Produção de lipases por fungos filamentosos : estudos cineticos e sintese de esteres

Penicillium citrinum, isolado como contaminante do óleo de oliva, foi o melhor produtor de lipase, quando comparado com o Gliocladium viride 136B e Fusarium lateritium 48, em meio contendo extrato de levedura (Meio ME, 2880 U/L) ou sulfato de amônio com sais minerais (Meio MA, 1585 U/L), utilizando óleo de oliva (1% v/v) como fonte de carbono, no pH inicial de 4,5. A maior atividade lipolítica específica (7,8 U/mg proteínas), livre de protease e da micotoxina citrinina foi obtida no meio MA. Não ocorreu alteração na produção quando foi utilizado 1-30 mM de KH2PO4 no pH inicial 4,5, entretanto, em concentrações acima de 50 mM ocorreu inibição na produção da lipase de Penicillium citrinum. A produção desta enzima em Meio ME foi maior (3200 U/L) usando fermentação em bateladas alimentadas ("fed-batch") com simples ou múltiplos pulsos de ácido oléico, ou linoléico, ou linolênico, ou Tween 80, numa concentração final de 0,04 ou 0,1% (v/v). O extrato enzimático bruto concentrado e liofilizado foi estável ao armazenamento à temperatura ambiente por 8 meses, enquanto que o filtrado bruto do meio de cultura armazenado a 6°C apresentou um tempo de meia-vida de 30-35 dias, e foi instável ao congelamento e descongelamento, perdendo 50% da atividade inicial. Ambas as lipases obtidas nos Meio ME e MA foram estáveis à temperaturas abaixo de 40°C durante 2 horas e totalmente inativadas à 60°C após 30 min de pré-incubação. A enzima produzida no Meio MA mostrou uma cinética de desativação térmica complexa e uma energia de ativação da desativação térmica de 22,4 ± 2,2 Kcal.mol, calculada de acordo com a equação de Arrhenius usando as primeiras constantes de decaimento. A lipase de Penicillium citrinum hidrolisou preferencialmente os triglicerídios contendo ácidos graxos de cadeia longa. Entretanto, em relação aos ésteres lipídicos do p-nitrofenol foi observada uma cinética de Michaelis-Menten com um KM aparente para o p-nitrofenilpalmitato (pNPP) de 0,502 ± 0,105 mM (Meio ME) e 0,332 ± 0,059 mM (Meio MA); 0,787 ± 0,001 mM para o p-nitrofenilmiristato (pNPM) e 1,74 ± 0,004 mM para o p-nitrofenillaurato (pNPL), usando a enzima produzida em meio MA. A lipase produzida em Meio MA foi capaz de catalisar a síntese do éster lipídico do glicerol, usando ácido oléico como doador do grupo acil, após 15h de incubação a 37°C, mas não catalisou a síntese do éster de ácido láurico de D-glucose complexada com ácido fenilborônico, após 24h de incubação a 45°C em álcool tert-butílico.Brazilian strain of Penicillium citrinum, isolated as a contamination from olive oil, was the best lipase producer on medium containing yeast extract (Medium ME, 2880 U/L) or ammonium sulfate plus mineral salt (Medium MA, 1585 U/L), using olive oil (1% v/v) as carbon source, the maximum specific activity was obtained on Medium MA (7.8 U/ mg proteins) at initial pH 4.5, free of protease and mycotoxin citrinin. There was no effect using KH2PO4 1-30 mM at initial pH 4.5, with concentrations higher than 50 mM there was inhibition of lipase yield. This production was improved on Medium ME (3200 U/L) using fed-batch fermentation with simple or multiple pulse of oleic, or linoleic, or linolenic acid, or Tween 80 at 0.04 or 0.1 % (v/v),final concentration. Penicillium citrinum lipase concentrated and lyophilised was stable during 8 months at room temperature (28-30°C), while the crude culture filtrate has shown a half-live of 30-35 days at 6°C. It was not stable at frozen and defrosted condition, losing 50% of initial activity. Both lipases (Media ME and MA) were stable at temperatures up to 40°C for 2 hours and completely deactivated at 60°C after pre-incubation during 30 minutes. The enzyme obtained from Medium MA has shown a complex kinetic of thermo and pH deactivation. The activation energy of the thermo deactivation was 22.4 + 2.2 Kcal.mol, according to Arrhenius equation using the fust decay constants. This lipase hydrolysed triglycerides containing long chain fatty acids preferably. ln relationship to lipidic esters of p-nitrophenyl, this lipase has shown a Michaelis-Menten kinetic, with apparent KM 0.502 ± 0.105 mM (Medium ME) and 0.332 ± 0.059 (Medium MA) for p-nitrophenylpalmitate (pNPP), while for p-nitrophenylmyristate (pNPM) and p-nitrophenyllaurate (pNPL) were 0.787 ± 0.001 mM and 1.74 ± 0.004 mM respectively, using lipase from Medium MA. Penicillium citrinum lipase catalysed the synthesis of glycerol ester using oleic acid as acyl donor, after 15 hours at 37°C, but it was not able to catalyse the synthesis of ester using D-glucose complexed with phenylboronic acid and lauric acid, after 24 hours at 45°C on tert-butilic alcohol