Efeito de flavonoides sobre a atividade enzimatica de fosfatases in vitro e in vivo

Flavonóides são compostos polifenólicos amplamente consumidos na dieta humana, podendo chegar ao consumo diário de 1,0 grama. Uma variedade de efeitos biológicos in vitro e in vivo é descrita para os flavonóides tais como: inibição e alteração da expressão enzimática, antioxidantes e pró-oxidantes, síntese e reparo de DNA, indução a apoptose e anti-tumorais. Fosfatases são enzimas da classe das hidrolases que catalisam a desfosforilação de monoésteres fosfatos e são divididas em três grupos principais: proteínas fosfatases, fosfatases ácidas e fosfatases alcalinas. Juntamente com as proteínas quinases, as proteínas fosfatases são responsáveis pelo mecanismo de fosforilação/ desfosforilação que controla os principais eventos celulares como crescimento, diferenciação e divisão celular.Após a purificação, caracterização cinética e eletroforética da fosfoproteína tirosina fosfatase de membrana de linfócitos (CD45), verificou-se que está enzima era inibida por morina na concentração máxima de 400mM (30%) e ativada por fisetina na mesma concentração (30%), sendo estes efeitos dependentes da concentração dos flavonóides analisados. Nos testes biológicos com a linhagem de células promielocíticas (HL60) pode-se verificar que, na concentração de 200mM, fisetina e morina foram capazes de promover 90% de morte celular, tendo sido determinados os valores de IC50 para os parâmetros de viabilidade celular. Três parâmetros foram utilizados para estabelecer a viabilidade cellular: atividade de fosfatase, redução de MTT e conteúdo proteico. Os resultados obtidos foram: 50 e 150mM para a atividade de fosfatase ácida total na presença de rutina e fisetina respectivamente; 45, 190 e 80mM para redução de MTT na presença de fisetina, morina e quercetina; e não foram obtidos valores correspondentes para o conteúdo total de proteínas. Já para cultura primária de linfócitos humanos, fisetina foi o único flavonóide que apresentou efeito tóxico e determinação do IC50 para os três parâmetros de viabilidade celular sendo de 75mM (para conteúdo de proteína total), 100mM (para atividade fosfatásica) e 200mM (para redução de MTT). Por outro lado, a quercetina, na concentração acima de 10mM, promoveu um aumento de 50% na quantidade de proteína total de linfócitos, sendo um indicativo de que possa estar induzindo a proliferação celular; no entanto, sem variar os outros parâmetros. Os resultados de Westem blotting para fisetina em cultura de HL60, indicaram a capacidade deste flavonóide de promover a ativação da MAPK p38 e de inibir as MAPKs ERK e JNK, sendo que este efeito pode resultar em atividade antiproliferativa nestas células. Os testes in vivo de quercetina e morina mostraram que estes flavonóides foram capazes de induzir o aumento de expressão de proteínas no fígado (17%). De maneira geral, a morina foi capaz de diminuir as atividades da fosfatase ácida total (F A T) e da fosfatase alcalina (FAlc) em 10 e 60% respectivamente, nos rins, e da FAT e fosfatase ácida de baixa massa molecular (FAB) em 45% e 40% respectivamente, no plasma. Já a quercetina apresentou a capacidade de aumentar a atividade fosfatásica em 15% para as FAB e FAlc no figado, 15%, 18% e 75% respectivamente, para as FAlc, FAB e TRAP (fosfatase ácida resistente a tartarato), nos rins e 100% da atividade fosfatásica da FAB no plasma sangüíneo. Assim, podese verificar que os flavonóides quercetina e morina, possuem todas as características estruturais importantes para apresentar os efeitos biológicos analisados, e uma pequena mudança na posição de uma hidroxila no anel do catecol já foi o suficiente para que estes flavonóides apresentassem efeitos antagônicosFlavonoids are polyphenolic compounds largely consumed in the human diet, and can reach a dairy consumption of 1.0 gram. A great variety of in vitro and in vivo biological effects has been described for the flavonoids, such as, inhibition and alteration of the enzyme expression, antioxidant and prooxidant, synthesis and repair of DNA, apoptosis induction and antitumoral. Phosphatases are enzymes of the class of hydrolases that catalyze the dephosphoryrilation of phosphate monoesters and are divided into three main groups: protein phosphatases, acid phosphatases and alkaline phosphatases. The protein phosphatases, in conjunction with the protein kinases, are responsible for the mechanism of phosphorylation/dephosphorylation that controls the main cellular events, such as, cellular growth, differentiation and division. A protein tyrosine phosphatase - CD45 - was purified from human membrane lymphocytes through gel filtration and ion exchange chromatograhies. The purified enzyme was inhibited 30% by 400 mM of the flavonoid morin, and activated (30%) at the same concentration of fisetin, in concentration-dependent processes. Biological tests with the human mieloid leukemia cells (HL60) showed that fisetin and morin promoted 90% of cellular death. Three parameters were used to establish the cell viability: phosphatase activity, MTT reduction, and protein content. The following IC50 flavonoid concentrations were obtained: 50 e 150mM for the total acid phosphatase activity in the presence of rutin and fisetin, respectively; 45, 190 e 80mM for the MTT reduction in the presence of fisetin, morin and quercetin, respectively; none corresponding flavonoid concentration values for the total protein content were obtained. For the primary human lymphocytes cultures, fisetin was the only flavonoid that exhibit toxic effects, with the following cell viability parameters: 75mM (protein content), 100mM (phosphatase activity) and 200mM (MTT reduction). On the other hand, concentrations of quercetin higher than 10mM promoted an increase of 50% in the protein content, an indication of cell proliferation, with no changes of the other parameters. Westem blot tests for fisetin in HL60 cultures indicated a capacity of this flavonoid to promote an activation of MAPK p38 and inhibitions of MAPKs ERK and JNK; these effects in HL60 can result in an antiproliferative activity . In vivo, quercetin and morin induced an increase in the protein expression in the liver (17%). In general, morin decreased the total acid phosphatase (FAT), and alkaline phosphatase (FAlc) activities in the kidney of about 10 and 60%, respectively; and FAT and low-molecular mass acid phosphatase (FAB) of 45% and 40%, respectively, in the plasm. In contrast, quercetin increased the enzyme activities 15% for FAB and FAlc in the liver; 15%, 18% and 75%, respectively for FAlc, FAB and tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) in the kidney; and 100% for the FAB activity in the plasm. Our results showed that the antagonic effects of quercetin and morin were related to small modifications in the structures of these flavonoids, ie, the change in the position of a hydroxyl group in the cathecol rin