Termotolerancia e efeito do jejum, realimentação e infecção por Trypanosoma cruzi na resposta a choques de temperatura em Panstrongylus megistus (Burmeister)

O efeito dos choques térmicos, quentes e mos, foi estudado buscando-se investigar a ocorrência de tolerância termal em Panstrongylus megistus. A taxa de sobrevivência e mudas foi acompanhada em ninfas de 5º estádio e alados de ambos os sexos de P. megistus após choques térmicos seqüenciais nos quais o primeiro foi de 35°C ou 40°C (1 h) (hipertérmico) ou de 5°C ou O°C (1 h) (hipotérmico) precedendo um choque mais severo de 40°C ou O°C (12 h), respectivamente. Os choques foram separados por intervalos de 8, 18, 24 ou 72 h a 28°C. A fim de se investigar se a tolerância termal nessa espécie era acompanhada por alterações nucleares, ninfas foram dissecadas após intervalos de 24 h, 10 e 30 dias seguindo-se o segundo choque, para determinação e contagem de fenótipos nucleares em túbulos de Malpighi. Demonstrou-se tolerância aos choques quentes e mos sendo que dependendo da temperatura do choque, do intervalo entre os tratamentos à 28°C, fase do desenvolvimento e sexo, a intensidade de tolerância desenvolvida diferiu. Enquanto a tolerância ao calor nas ninfas se verificou quando o período entre os choques foi de até 24 h (choque inicial a 35°C) ou mais (choque inicial a 40°C), taxa expressiva de tolerância nos alados foi verificada apenas em condições de 8 h de intervalo entre os choques, sendo o choque inicial dado a 40°C. Também diferindo do que acontece nas ninfas, cuja tolerância ao choque mo se expressou de modo semelhante em todas as situações analisadas, nos alados foi demonstrada expressiva tolerância ao choque mo apenas quando o choque inicial foi dado a O°C e o tempo entre choques seguidos ultrapassou 18 h. As fêmeas apresentaram maior tolerância termal. Os resultados de tolerância termal foram os primeiros reportados em triatomíneos e sugerem o envolvimento de proteínas de choque térmico (HSP), embora outros mecanismos possam também estar envolvidos. Essa ação protetora, no entanto, parece perder a eficácia com o desenvolvimento do inseto. Igualmente foram encontrados modelos diferentes de alterações nos fenótipos nucleares induzidos pelos choques quentes e mos e identificados após reação de Feulgen. Tolerância ao choque quente envolveu alterações morfológicas representadas por um decréscimo na forma de morte celular por apoptose simultaneamente a um aumento nas respostas de sobrevivência celular. Choques mos seqüenciais não envolveram fusão celular/nuclear e ainda elicitaram aumento de necrose com a avanço do tempo pós-choque. As temperaturas de 40 e 0° C foram mais efetivas que as temperaturas de 35 e 5°C em elicitar tolerância ao calor e ao mo, respectivamente, como foi demonstrado pela análise dos fenótipos nucleares. Diferentes choques térmicos podem ativar diferentes mecanismos de proteção celular contra o estresse em P. megistus, favorecendo uma adaptação do inseto a vários ecótopos. O efeito do jejum seguido por realimentação e choque térmico nos fenótipos nucleares de P. megistus foi também estudado citologicamente em túbulos de Malpighi de ninfas de 40. estádio. Os insetos foram mantidos em jejum até 100 dias a 28°C e sua sobrevivência examinada diariamente. Parte dos insetos em jejum foi realimentada e parte dos insetos em jejum, ou realimentados após jejum, recebeu um choque de 40°C por 1 h. A análise dos fenótipos foi procedida 1 e 7 dias após tais procedimentos. Detectou-se que após 40 dias de jejum, a taxa de sobrevivência dos espécimes foi alta (90)%), decrescendo logo após. Com o avanço do tempo de jejum, a frequência de necroses aumentou. Realimentação após jejum agiu como um estresse médio, aumentando a frequência de apoptose. Ausência de núcleos gigantes foi observada em todos os insetos. Embora o choque térmico tenha promovido um aumento na frequência de núcleos necróticos, não afetou a resposta ao jejum e à realimentação, já que não se verificou uma associação entre os fatores. Espécimes bem nutridos apresentaram uma menor taxa de fenótipos alterados quando comparados a espécimes mantidos em jejum ou realimentados após o jejum. Uma vez que períodos de estresse nutricional podem influenciar a distribuição geográfica e temporal das espécies, as alterações celulares, de morte ou proteção, podem contribuir para o conhecimento do comportamento de P. megistus em condições naturais e em laboratório. O efeito dos choques térmicos em espécimes infectados com Trypanosoma cruzi sobre a incidência de sobrevivência e mudas, fenótipos nucleares, prevalência e intensidade de infecção por Trypanosoma crozi bem como multiplicação e metaciclogênese, inclusive após choque quente (40°C, 1 h), foi investigado em P. megistus. Ninfas de 4º. instar foram submetidas a infecção com a cepa Y de T. crozi e acompanhadas durante 45 dias. O número de epimastigotas e tripomastigotas foi determinado por exame do conteúdo da glândula retal e os fenótipos nucleares de P. megistus estudados em seus túbulos de Malpighi. Demonstrou-se que o choque térmico não promoveu diferenças na sobrevivência e na incidência de mudas em espécimes infectados e não infectados. A infecção promoveu aumento na taxa de sobrevivência e decréscimo na ocorrência de mudas. Não houve diferença significante quanto à prevalência e à magnitude de infecção em espécimes submetidos ou não a choque térmico. Os espécimes submetidos a choque tiveram um decréscimo no número de epimastigotas e tripomastigotas, indicando que alterações na multiplicação do parasita e na metaciclogênese foram induzidas pelo choque térmico. Somente para núcleos com suspeita de apoptose, os fatores infecção e estresse, isoladamente, foram significantes, sugerindo que a presença do parasita possa ser um estímulo para indução do programa de morte celular. As alterações induzidas pela infecção em associação ao choque térmico, especialmente com relação à multiplicação e metaciclogênese, poderão vir a contribuir para nossa compreensão do sistema vetor-parasita, dos modelos epidemiológicos envolvidos e criação adequada desses insetos em laboratórioThe effects of heat and cold shocks on thermal tolerance in Panstrongylus megistus were studied. The incidence of survival and molting in fifth-instar nymphs and adults was determined following treatments in which a mild heat shock (35°C or 40°C, 1 h) or cold shock (5°C or O°C, 1 h) preceded a more drastic shock (40°C or O°C, 12 h), respectively. Sequential shocks were separated by intervals of 8, 18, 24 or 72 h at 28°C (control temperature). To investigate whether insect survival was accompanied by nuclear changes, fifth-instar nymphs were dissected 1, 10 and 30 days after the second shock and the frequency of nuclear phenotypes present in the Malpighian tubules was determined. Heat and cold shock tolerance was induced but varied according to shock temperature, interval between shocks at 28°C, developmental stage and sex. In contrast to the response in nymphs, for which higher values of heat tolerance were sustained for up to 24 h (preliminary shock at 35°C) or even longer (preliminary shock at 40°C) between sequential shocks, in adults marked tolerance was seen only when the intervals between shocks was ? 8 h (preliminary shock at 40°C). Also in contrast to nymphs, which exhibited cold-tolerance is all conditions, adult insects acquired tolerance to more severe shocks only when the preliminary shock was given at O°C and the time between shocks was greater than 18 h. Females showed greater tolerance than males. These results are the first to show thermal tolerance in a bloodsucking hemipteran and suggest the involvement of heat shock proteins, although other protective mechanisms may also be operating. This cellular protection may become less effective as the insect develops. Heat and cold shocks produced different patterns and frequencies of nuclear phenotypes as shown by the Feulgen reaction. Heat shock tolerance involved a decrease in apoptosis and a simultaneous increase in cell survival responses' Sequential cold shocks did not involve cell/nuclear fusion and even elicited an increase in necrosis with increasing time after the shock. Temperatures of 40° and O°C were more effective than 35° and 5°e in eliciting heat and cold shock tolerance, respectively, as shown by cytologica1 analysis of the nuclear phenotypes. Different sequential thermal shocks can tigger different mechanisms of cellular protection against stress in P. megistus and may allow the insect to adapt to various ecotopes. The effect of fasting in association with refeeding and heat shock on the nuclear phenotypes of P. megistus was studied cytologically in Malpighian tubules of fourth-instar nymphs. The insects were fasted up to 100 days at 28°C and their survival followed daily. Groups of nymphs were separated each month, with part of the group being refed and the other part kept fasting. Insects in each of these subgroups received either a heat shock at 40°C for 1 h or where maintained at 28°C (no heat shock). The Malpighian tubules were removed 1 and 7 days after each assay and subjected to the Feulgen reaction for identification and counting of the nuclear. Insect survival was high (900.10) after 40 days of starvation but decreased thereafter. Only necrosis increased with the duration of fasting. Feeding after fasting acted as a mild stressing agent and increased the frequency of apoptosis. No giant nuclei was observed in the insects. Although heat shock increased the frequency of necrotic nuclei it did not affect the starvation and refeeding responses since there was significant interaction between factors. Well-nourished specimens showed a smaller frequency of altered phenotypes than starved or refed insects. Since periods of nutritional stress influence the geographic and temporal distribution of a species, cellular changes such as death or protective mechanisms can contribute to our understanding of the biological behaviour in P. megistus in natural or laboratory conditions. The incidence of survival and molting, the frequency of nuclear phenotypes, the frequency of infection by T. cruzi, and the grades of metacyclogenesis, including after heat shock (40°C, 1 h), were also investigated. Fourth-instar nymphs infected with the strain Y of T. cruzi and monitored for 45 days therea:fter. The number of epimastigotes and trypomastigotes was determined by examining the rectal gland contents. The Malpighian tubules were used to determine the nuclear phenotypes. Heat shock did not alter differences in the survival and molting rates in infected, compared to non-infected insects. However, infection increased the survival and decreased the molting rates. There were no significant changes in the prevalence and magnitude of infectivity following heat shock. Shocked insects showed reduced number of epimastigotes and trypomastigotes, indicating that changes in the multiplication of the parasite and metacyclogenesis were affected by heat shock. Infection and stress increased the frequency of nuclei suspected of apoptosis and suggest that the presence parasite could induce apoptosis. The changes induced by infection in association with heat shock, especially the multiplication and metacyclogenesis of T. cruz; and the mechanisms of resistance developed in the vector, may contribute to our understanding of the vector-parasite system, of the epidemiological patterns involved and adequate rearing of P. megistus in the laborator