Purificação e caracterização molecular da lisina-cetoglutarato redustase de endospermas de milho (Zea mays L.)

Neste trabalho, foram determinadas algumas características da enzima lisina-cetoglutarato redutase (EC1.5.1.8) de endospermas normais e opaco-2 da linhagem homozigota de milho - L 1038. A exemplo do que ocorre em mamíferos, esta enzima deve participar do primeiro passo do catabolismo de lisina e catalisa a reação:Lisina + alfa-cetoglucarato + NADPH -> sacaropina + NADP+Durante o desenvolvimento do endosperma, a atividade de LKR mostrou variações significativas em ambos os genótipos, as quais, parecem ser coincidentes com a sua síntese, sendo que, ela aumentou logo no início do desenvolvimento da semente, encontrou um pico aos 20-25 dias após a polinização e decresceu, em seguida, em direção à maturidade da semente. O padrão de atividade, no endosperma opaco-2, é drasticamente diminuído em relação ao normal, chegando a ser três vezes menor que este nos estágios intermediários do desenvolvimento do endosperma. Ao mesmo tempo, quando extratos de endospermas normais e mutantes opaco-2 foram submetidos à eletroforese em géis de poliacrilamida (sob condições não-denaturantes), e a seguir, a atividade de LKR foi revelada em gel, uma banda correspondente à atividade da enzima, foi possível de ser visualizada somente no material normal. Estes resultados indicam que a enzima LKR está sob controle do gene opaco-2.Cerca de 3.000 endospermas da versão normal, no período de maior atividade de LKR, foram utilizados para a purificação da enzima através de uma seqüência de passos de fracionamento em sulfato de amônio, ultracentrifugação e cromatografias de troca iônica e afinidade. A preparação mais pura obtida da cromatografia de afinidade foi enriquecida 275 vezes e tinha uma atividade específica de "414 nmoles de NADPH.min-1.mg de proteína-1. A enzima deve ser uma monômero de Mr 130.000 a 160.000, conforme determinado por filtração em gel Sephadex G-200, ultracentrifugação em gradientes de sacarose e eletroforese em géis de poliacrilamida. A banda mais intensa de Mr 134.000, proveniente da eletroforese sob condições denaturantes da enzima purificada, foi utilizada para a preparação de anticorpos policlonais, em coelhos New Zealand. Os experimentos de " Western blot, utilizando-se estes anticorpos, foram realizados com os extratos provenientes dos diferentes passos da purificação da enzima, resolvidos por eletroforese em gel de poliacrilamida (sob condições denaturantes). Os resultados demonstraram o reconhecimento, por parte destes anticorpos, de uma única banda de Mr 130.000 nos extratos purificados. Entretanto, nos extratos da centrifugação a 3.000 X g ou a 22.000 X g e naqueles fracionados com sulfato de amônio, além desta banda, uma segunda banda de menor peso molecular (Mr = 80.000), foi também reconhecida por estes anticorpos. A origem desta banda, até o momento nos é desconhecida, desde que todos os resultados obtidos, neste trabalho, indicam a existência de uma única forma da enzima na fração solúvel de endospermas normais e mutantes opaco-2. A enzima de milho tem propriedades bastante similares às enzimas de fígado e placenta humanos, tais como: requerimento pelo cofator NADPH, pH ótimo, termoestabilidade e inibição pelo produto ? sacaropina. A cinética da enzima mostrou ser bastante complexa para ambos substratos. Os valores de Km encontrados para lisina foram de 8,7 e 4,1mM, respectivamente para as versões normal e opaco-2Lysine-ketoglutarate reductase (LKR, EC 1.5.1.8) was investigated in endosperms of homozygous normal and opaque-2 versions of L1038 maize inbred line. The enzyme catalyses the following reaction: Lysine + a-ketoglutarate + NADPH -> saccharopine + NADP+The enzyme activity in both genotypes increased with the onset of seed development, reached a peak around 20 days after pollination and then decreased towards seed maturity. The enzyme activity of opaque-2 endosperm was 2-3 times lower than the normal endosperm. Extracts from normal and opaque-2 endosperms were resolved by polyacrilamide gel electrophoresis and developed for LKR activity. A band corresponding to the enzyme activity was detected only in the normal extract. These results suggest that LKR is under control of opaque-2 gene. Three thousand endosperms of the normal version of L1038 taken at the period of highest enzyme activity were used for the purification of LKR trough a sequence of steps including ammonium sulfate fractionation, ultracentrifugation, and ion-exchange and affinity chromatography. The purest preparation obtained after affinity chromatography was 275 fold enriched and had a specific activity of 414 nmol.min-1.mg protein-1. The molecular weight of the enzyme as determined by gel filtration, gradient centrifugation and gel eletropheresis was in the range of 130.000 to 160.000. Polyclonal antibodies against the purified enzyme were raised in rabbits. Western blot analysis using anti-LKR antibodies was carried out with extracts of different purification steps resolved by sodium dodecil sulfate polyacrilamide gel eletrophoresis. A single immunoprecipitated band of 130.000 was observed in the purified extract. In crude and ammonium sulphate fractionated extracts an additional band of 80.000 cross-reacted with the anti-LKR antibodies. The origin of this band is unknown, since all other data demonstrated a unique form of LKR both in normal and opaque-2 endosperms.The maize enzyme was very similar to that found in human tissues in several aspects, including specificity for NADPH, pH optimum, thermal stability, and product inhibition. Kinetic studies with lysine and alfa-ketoglutarate revealed complex Km for both substrates. The Km for lysine was 8,7 and 4,1 mM, respectively for normal and opaque-2 material