Uma abordagem proteomica na identificação do citocromo P450 em Prochilodus Scrofa : uma nova ferramenta em ensaios ecotoxicologicos

Citocromos P450 (CYP) constituem uma superfamília de heme proteínas envolvidas na fase I da biotransformação que participa da detoxificação de compostos endógenos e exógenos. Para que esta atividade seja exercida existe a necessidade da associação do CYP com o citocromo b5 e com a enzima NADPH citocromo P450. Esta associação só ocorre graças ao ambiente de membrana. Qualquer alteração na uniformidade do ambiente lipídico leva à alterações na funcionalidade do sistema CYP. Baseado nesta informação e no fato de que vários poluentes têm sua solubilidade aumentada pela adição destes compostos, realizamos testes in vitro utilizando microssomas hepáticos de Curimbatá (Prochilodus scrofa) - um peixe tropical brasileiro pertencente a família Prochilodontidae - e observamos que dois surfactantes normalmente utilizados na solubilização de pesticidas, o Triton X- 100 e o Tween 80. O conteúdo total de CYP e a atividade da EROD foram fortemente inibidos pelo Triton X-100 e pelo Tween 80 de uma maneira dose dependente; o conteúdo de CYP foi reduzido à zero. A atividade da EROD foi completamente inibida pelo Triton X-100 e inibida em mais de 40% na presença do Tween 80. A estrutura molecular do surfactante influencia na alteração que o sistema irá sofrer visto que ambos são hábeis em interagir com as proteínas do sistema microssomal, em especial as monooxigenases, alterando sua conformação e, consequentemente, destruindo sua função. Os resultados desta primeira parte mostraram que os surfactantes interagem com os componentes do sistema microssomal hepático levando a inibição do sistema. A atividade do CYP, que foi usada como biomarcadora de exposição ao xenobiótico pode ser utilizada como marcadora em associação com outras enzimas. Estes resultados levantaram a hipótese de que os surfactantes também poderiam alterar a atividade do CYP quando utilizados em processos de purificação. Por ser uma proteína de membrana, o CYP precisa ser solubilizado antes de ser purificado. No entanto os surfactantes utilizados durante o processo poderiam levar a destruição do CYP, mascarando a real concentração do CYP obtido durante o processo. Sendo assim, na segunda parte deste trabalho desenvolvemos um novo método de purificação que exclui a necessidade de surfactantes durante o processo de purificação. A purificação do CYP1A foi feita utilizando-se uma coluna C18 associada à HPLC de fase reversa. O CYP purificado foi caracterizado em relação as suas propriedades eletroforéticas, imunoquímica e atividade biocatalítica. A fração isolada como CYP produz uma única banda uniforme com massa molecular ao redor de 58.000 Da em SDS - PAGE e mostra uma forte reatividade cruzada com anticorpos produzidos contra o CYP1A de trutas. A fração isolada também foi encapsulada em dois tipos de sistemas reconstituídos, um composto por lipídeos neutros e outro por lipídios negativamente carregados. Em ambos os sistemas foi possível detectar a atividade da EROD, mas não a atividade da PROD, confirmando que a fração purificada corresponde a CYP1A e teve todas as suas características enzimáticas conservadas. Houve um aumento da atividade quando a o CYP1A foi encapsulado nas vesículas contendo lipídeos negativamente carregados, confirmando que a carga do lipídeo é essencial para a manutenção das características enzimáticas do CYP. O processo se mostrou eficaz para a purificação do CYP1A mantendo todas a suas características conservadas. No entanto não permitiu a separação das isoformas CYP1A. A terceira parte do projeto teve como objetivo a identificação das isoformas CYP1A1 e CYP1A3 através de eletroforese bidimensional associada à espectrometria de massas do tipo MALDI-TOF. Foram identificados 3 spots com a mesma massa molecular, mas com pIs variando entre 5,5 e 6,5, sugerindo a presença de três isoformas do CYP1. Os spots foram selecionados e tratados com tripsina. O mapa de peptídeos obtidos através da digestão dos spots selecionados teve suas massas identificadas por espectrometria de massas do tipo MALDI-TOF e através da digestão teórica de seqüências de CYP já existentes no banco de dados. Houve a identificação de 10 picos que correspondem a 31% do total de aminoácidos traduzidos para a família CYP1A de peixes e mamíferos. Todos os três spots tiveram o mesmo padrão de fragmentação confirmando que eles são isoformas CYP1A1 e CYP1A3. Dentre estes peptídeos, dois demonstraram maior importância, o pico T3, que representaria um domínio conservado do CYP1A e o pico T2, que representaria uma região conservada apenas em peixes. Os resultados sugerem fortemente que este novo procedimento seria eficiente para identificar, simultaneamente, diferentes isoformas do CYP1A hepático e suas regiões conservadas. Dada a sensibilidade das técnicas de proteômica, nesta ultima fase do projeto propomos o uso da eletroforese bidimenisonal associada à espectrometria de massas na identificação de isoenzimas de P450 diferencialmente expressas em microssomas hepáticos de Curimbatás tratados com 3 ? metilcloranteno (3-MC). A avaliação das proteínas expressas em cada tratamento foi feita através de eletroforese uni e bidimensional e a identificação feita através da análise de massa de peptídeos. Ambas as eletroforeses permitiram a identificação de proteínas induzidas de maneira diferencial pelo 3-MC, embora a eletroforese tenha sido mais efetiva na identificação de proteínas altamente homólogas, como a CYP1A1 e CYP1A3. Também foi possível a identificação de outras proteínas atuantes na detoxificação de xenobióticos, dentre elas o citocromo b5 (~15kDa) e a glutationa ? S ? Transferase microssomal (~20kDa). Os dados demonstrados no projeto mostram claramente que o sistema associado a abordagem proteômica têm um grande potencial para serem utilizados na identificação de proteínas expressas diferencialmente conforme a situação ambientalCytochromes P450 constitute a superfamily of the phase I enzymes whose primary task is the detoxification of both endogenous and xenobiotic compounds. This activity is only possible through the association of CYP with cytochrome b5 and the enzyme NADPH cytochrome P450 reductase. This association is possible because of membrane environment. Any alteration in this environmet leads to altereation on the functionality of CYP system. Based on this information and in the fact that various pollutants have its solubility increased by the surfactant addition, we had done in vitro tests using hepatic microsomes of Curimbatá - a Brazilian fish belong the family Prochilodontidae ? and observed the effects of Triton X-100 and Tween 80 in CYP system. Both surfactants are commonly used in pesticides solubilization. Total CYP and EROD were strongly inhibited by Triton X-100 and Tween 80 in a concentration-dependent way; the content of CYP was reduced until zero while EROD activity was completely inhibited in the presence of Triton X-100 and more than 40% inhibited in the presence of Tween 80. Each surfactant causes a different effect on each antioxidant enzyme. No effect was detected in SOD activity in the presence of even Triton X-100 or Tween 80. Triton X-100 increase catalase activity, while Tween 80 decreases this enzyme activity. The molecular structure of the surfactants causes the alteration of this system, since they are able to interact with the microsomal protein, especially with monooxigenase?s components, altering their conformation and, consequently destroying their function. Our results in this first part suggest that surfactants can interact with components of the microsomal system leading to inhibition of CYP. Therefore, CYP activity, which has been used as a biomarker of xenobiotic exposure, should be used as a marker in association with other enzymes. With those results we suggest the hypothesis that surfactants that are commonly used in the purification process could alter the CYP activity. Since that CYP is a membrane protein, the solubilization process is necessary before the purification process to separated membrane lipids of proteins. The use of surfactants in the process could mask the real concentration of CYP obtained. Then, in the second part of this project we develop a new method to of purification that excludes the necessity of surfactants. The purification of CYP1A was done by Reverse Phase HPLC on a C18 column. Purified CYP1A was characterized with respect to electrophoretic, immunochemical and biocatalyst properties. CYP1A fractions produced a single uniform band on SDS-PAGE with an apparent molecular mass of 58 kDa. Purified CYP1A of P. scrofa showed strong cross-reactivity with antibodies directed against CYP1A from trout. The fraction was also encapsulated in two different reconstituted systems; one composed of neutral lipids and another of negatively charged lipids. In both of them, we could detect EROD activity but not PROD activity, which confirms that the CYP1A was purified with all its enzyme activity. There was an increase of activity when CYP1A and NADPH cytochrome P450 (CYP) reductase were encapsulated in negatively charged lipids, which confirms that the charge of lipid is essential to CYP1A activity. All these characteristics strongly suggest that this new procedure is efficient for purifying hepatic CYP1A from P. scrofa, showing that the CYP1A isoform of this fish has a highly conserved protein region. However the process was not efficient to separate the isoforms of CYP1A. In the third part of project we aimed the identification of CYP1A1 and CYP1A3 isoforms through bidimensional electrophoresis and MALDI ? TOF mass spectrometry. Three major spots were detected. These spots had the same molecular weight, but presented pI in a range of 5.5 to 6.0, suggesting the presence of 3 isoforms of CYP1. Spots were collected, and treated with Trypsin and the resultant peptides were measured by MALDI-TOF Mass Spectrometry. Tryptic peptide mass fingerprint of CYP1A showed the presence of 10 masses that matched the expected tryptic peptides obtained through theory digestion of the database sequence. These values corresponded to 31% of the translated amino acids of CYP1A family of other fishes and mammals. All spots had the same profile of fragmentation, which confirms that they are isoforms. Among these peptides, two demonstrated major importance T3, which is a conservative domain of CYP1A and T2, which could represent a more conservative region that occurs only in fishes. All these characteristics strongly suggest that this new procedure efficiently identifies, simultaneously, different isoforms of hepatic CYP1A from P. scrofa and its conservative region of protein. Due to the sensibility of the technique, in this last part of the project we try to identify the CYP isoenzymes that are expressed in hepatic microsomes of Curimbatá using one ? dimensional (1 ? DE) and two dimensional (2 ? DE) gel electrophoresis followed by tryptic peptide mapping (PMF). Both 1 ?DE and 2 ? DE showed that 3 ? MC induces not only CYP1A1 and CYP1A3, but other biotransformation enzymes presents in endoplasmic reticulum like cytochrome b5 (~15kDa), NADPH cytochrome P450 reductase (~75kDa) and microsomal Glutathione ? S ? Tranferase (~20kDa). There were 25 proteins that appeared only in 3 ? MC treated group and a matching of 38% between control and 3 ? MC gel. The results demonstrated here show that CYP system associated to the proteomic approach have great potential to be utilized in the identification of proteins differentially expressed according to environmental situatio