Regulação do sistema NADFH oxidase de macrofagos do colostro humano

Os fagócitos, dentre eles, macrófagos, granulócitos e eosinófilos contêm uma NADPH oxidase associada à membrana, a qual produz superóxido e outros intermediários do oxigênio, os quais têm importante papel na defesa contra infecções. O colostro humano, além de suas propriedades nutricionais, é considerado uma importante fonte de fatores imunoprotetores para os neonatos. Os macrófagos do colostro constituem parte destes fatores imunoprotetores. O objetivo deste trabalho foi estudar a atividade do sistema NADPH oxidase e a expressão do gene CYBB, que codifica a glicoproteína gp91-phox, em macrófagos do colostro humano, e compará-Ias às de monócitos do sangue periférico e células mielomonocíticas humanas THP-l. Tais células foram cultivadas com IFN-y e TNF-a durante 48 horas. A seguir, a liberação de superóxido foi determinada espectrofotometricamente por meio da redução do cito cromo c especificamente inibida pela superóxido dismutase. A expressão do gene CYBB, que codifica o componente gp91-phox, foi determinada por meio de RT -PCR quantitativo-relativo. Nossos resultados mostram que a liberação espontânea de superóxido por macrófagos do colostro foi superior à de monócitos do sangue periférico. Contudo, ao serem estimulados com PMA e as citocinas IFN-y e TNF-a, macrófagos de colostro e monócitos do sangue periférico apresentam atividade NADPH oxidase equivalente. A liberação de superóxido por macrófagos do colostro e monócitos do sangue periférico foi sempre superior à de células THP-l, mesmo sendo estas, estimuladas com PMA e as citocinas IFN-y e TNF-a. Tais citocinas aumentaram a expressão relativa do gene gp91-phox em células THP-l, mas não em monócitos de sangue periférico e em macrófagos do colostro. Desta forma, após a cultura com as citocinas, as células THP-l passaram a apresentar expressão relativa do gene gp91- phox semelhante às outras duas populações, sem contudo, apresentar atividade NADPH oxidase equivalente, demonstrando que a atividade NADPH oxidase final na linhagem mielomonocítica humana é regulada em parte pela expressão do gene CYBB, é o produto de diferentes eventos do metabolismo celular e está relacionada ao estado de diferenciação celularPhagocytes like macrophages, granulocytes and eosinophils have a membrane-associated NADPH oxidase system, responsible for the production of superoxide and other oxygen reactive intermediates, considered critical factors for the defense against infections. The human colostrum is an important source of human macrophages. The aim of this work was to compare the NADPH oxidase activity and gp91-phox expression in 3 human myelomonocytic cell Unes: colostrum macrophages, the same mother' s blood monocytes, and THP-I cells. Specifically these cells were cultured with and without IFN-y and TNF-a during 48 hours. The assays included the spontaneous and PMA (30 nM)-induced superoxide release and the relative expression ofgp91-phox by RT-PCR. The principal results were: 1) Spontaneous superoxide release: Colostrum macrophages cultured in basal conditions release more superoxide than blood monocytes. IFN-y and TNF-a caused a significant increase in the superoxide release of blood monocytes. Colostrum macrophages were also stimulated by IFN-y and TNF-a but did not reach statistical significance. 2) PMA (30 nM)-induced superoxide release: IFN-y and TNF-a caused a significant increase in the superoxide release by blood monocytes, colostrum macrophages and THP-I cells. Colostrum macrophages and blood monocytes released much more superoxide than THP-I cells in all conditions. 3) Gp91-phox expression by relative RT-PCR analysis IFN-y and TNF-a did not interfere in gp91-phox relative expression of colostrum macrophages. IFN-y and TNF-a caused a discrete increase in gp91-phox expression of blood monocytes. IFN-yand TNF-a caused a dramatic increase in gp91-phox expression of THP-I cells. Overall, afier IFN + TNF incubation, THP-I cells, colostrum macrophages and blood monocytes presented the same relative leveI of gp91-phox expression. Our conclusions were: The basal NADPH oxidase activity is higher in colostrum macrophages compared to blood monocytes. IFN-y and TNF-a drive blood monocytes to behave like colostrum macrophages. The NADPH oxidase activity of colostrum macrophages does not respond to IFN-yand TNF-a. Although IFN-y and TNF-a drive THP-I cells, colostrum macrophages and blood monocytes to present the same relative leveI of gp91-phox expression, the 81 NADPH oxidase activity in macrophages and monocytes is much higher than in THP-I cells. Other factors in these more mature cells up-regulate the NADPH oxidase activity, providing strong and contrasting evidence that the NADPH oxidase activity in the human myelomonocytic lineage is regulated only in part by gp91-phox gene expressio