Caracterização bioquimica e biologica de duas isoformas de BthTX-II:Bj-IV e Bj-V (PLA2) isoladas do veneno de Bothrops jaracussu

Bothrops jararacussu é uma espécie de grande importância epidemiológica no estado do Rio de Janeiro. No entanto a sua distribuição é ampla, pois pode ser encontrada nos estados de Santa Catarina, Paraná, Mato Grosso, São Paulo, Minas Gerais, Espírito Santo, Sul da Bahia e também na Argentina, Paraguai e Bolívia. De um modo geral, os venenos botrópicos das espécies brasileiras foram pouco estudados tanto em relação aos seus componentes isolados como quanto ao veneno total, devido ?a falta de otimização das técnicas de purificação capazes de revelar a presença de novos componentes ou de suas isoformas. Desta forma justifica-se o interesse no isolamento e caracterização de duas novas isoformas de BthTX-II PLA2 (D49), lembrando que esta última citada é uma fração importante no veneno de Bothrops jararacussu. As isoformas foram isoladas em uma coluna de troca iônica catiônica (Protein Pack SP 5PW Waters) acoplada a um sistema LC 650 (Waters), sendo caracterizadas como isoformas de BthTX-II e denominadas como Bj-IV e Bj-V. O alto grau de pureza foi revelado ao serem re-purificadas em uma coluna de hidrofobicidade µ-Bondapack C18 acoplada a um sistema de HPLC de fase reversa, sendo eluídas em tempos de retenção muito próximos (Bj-IV 31,25 ± 0,31 minuto e para Bj-V 31,31 ± 0,28 minuto). A caracterização físico-química revelou o fato de serem isoformas, pois apresentaram vários fatores similares como, a tendência para a formação de dímeros na eletroforese com ausência de redutores, sendo que o valor de massa molecular relativa encontrada para isoformas foi de ~14 kDa, através da eletroforese em SDS-PAGE Tricina (16,5%) também, a basicidade semelhante e o alto grau de hidrofobicidade, confirmados pela composição de aminoácidos. A caracterização cinética das isoformas de BthTX-II PLA2 (D49) mostrou que tais isoformas são altamente estáveis e apresentam um pH ótimo ao redor de 8,0 e temperatura próxima a 37ºC. Frente a diferentes concentrações de substrato as isoformas mostraram um comportamento tipo alostérico, em nossas condições experimentais. Na ausência de Ca+2 (1Mm) e na presença de alguns íons divalentes tais como Mn+2, Mg+2, Zn+2, Cu+2 (na concentração de 10 mM) as isoformas Bj-IV e V foram inibidas, já na presença de Ca+2 (1mM) e com os mesmos íons divalentes citados elas mostraram uma discreta atividade. Também foi demonstrado o efeito inibitório de crotapotinas crotálicas sobre a atividade PLA2 das isoformas, fato que sugere a possível presença de crotapotinas ?like? no veneno botrópico. A análise da composição de aminoácidos confirmou o comportamento estável de sua atividade cinética, ao mostrar um alto conteúdo de aminoácidos hidrofóbicos, assim como a presença de 14 cisteínas envolvidas em possíveis sete pontes dissulfeto. A presença de um alto conteúdo de aminoácidos básicos como Lys, His e Arg, também confirmaram o caráter básico das isoformas, característica própria do veneno deste tipo de víperide sul americano. O estudo de homologia seqüencial da região N-terminal entre ambas isoformas e também com outras PLA2 (D49) revelou um alto grau de homologia, no entanto, foram encontradas algumas substituições que não contribuíram com diferenças significativas, tanto com relação à atividade catalítica quanto neurotóxica. O efeito neurotóxico das isoformas de BthTX-II PLA2 (D49) Bj-IV e V, foi avaliado usando-se duas preparações farmacológicas: nervo frênico-diafragma isolado de camundongo e biventer cervicis de pintainho. Foram encontradas diferenças em ambas preparações, pois o efeito de bloqueio da resposta contrátil evidenciou-se de maneira significativa na preparação nervo frênico-diafragma isolado de camundongo, nas concentrações empregadas (50 e 100 µg/mL), enquanto que na preparação biventer não houve efeito notório. No entanto, para a dosagem de 100 µg/mL, no caso do veneno total na preparação biventer cervicis de pintainho evidenciou-se um efeito miotóxico indireto pois, foi observada uma diminuição nas respostas contraturante dadas pela diminuição das curvas de KCl e Acetilcolina (ACh). A importância do isolamento das isoformas de BthTX-II, Bj-IV e V, está apoiada no fato de ter sido possível a obtenção destas duas novas isoformas, usando-se métodos que garantiram a manutenção da sua atividade biológica, sendo assim possível correlacionar a estrutura e a função desta família de proteínas.Bothrops jararacussu is a species of great importance in the state of Rio de Janeiro, but its has a wide distribution: from Argentina, state of Santa Catarina, Paraná, Mato Grosso, São Paulo, Minas Gerais, Espírito Santo, south of Bahia, Paraguay and Bolivia. In a general the venom botropics of the Brazilian species, were probably rarely studied in relation to their isolated components as the total venom, due to a lack in the optimization of technologies to isolate the presence of new components or isoforms. In this way it justified to isolate and to characterize two new isoforms of these of BthTX-II PLA2 (D49) is a important fraction in the venom of Bothrops jararacussu, which were isolated through a column of exchange cationic (Protein Pack SP 5 PW Waters) coupled to a system LC 650 (Waters), being characterized as isoforms of BthTX-II and denominated Bj- IV and Bj-V. The high degree of purity was revealed and was eliminated in very close times of retention (Bj-IV 31.25 ± 0.31 minutes and Bj-V 31.31 ± 0.28). The physical-chemistry characterization revealed the reason of being isoforms, because they present several similar factors, such as the tendency of forming aggregates through the electrophoreses PAGE in the absence of SDS, as well as the mass is around 14 kDa characterized in the electrophoreses SDS-PAGE Tricina (16%). The kinetic characterization of the isoforms of BthTX-II PLA2 (D49) showed that isoforms are higly stable and they present good pH around 8,0 and a good temperature around 37 0C. Different concentration substrates showed a behavior type allosteric under our experimental conditions. In the presence of some ions such divalents as Mn+2, Mg+2, Zn+2, Cu+2 (in the concentration of 10 Mm) and in the absence of Ca+2 the isoforms Bj-IV and Bj-V, were inhibited. But in the presence of Ca+2 (1mM) the isoforms showed a discreet activity. The effect of the inhibition of crotapotins crotalics were also demonstrated in the activity PLA2, it is suggested that there is probably a presence crotapotin in these PLA2. The analysis composition of amino acids confirmed the stable behavior of its enzymatic kinetics when showing a high content of amino acids hidrophobics, as well as the presence of 14 cysteine involved in 14 bridges disulfide. The presence of a high content of basic amino acids as Lys, His and Arg confirmed the basic character of the isoforms. The study of the N-terminal region of both isoforms in relation to other PLA2 reveals a high homology degree, nevertheless some substitutions observed didn`t show significant differences in the catalytic and neurotoxic activity. The neurotoxic effect of the isoforms of BthTX-II PLA2 (D49): Bj-IV and Bj-V were evaluated using two pharmacological preparations: nerve isolated frenic-diaphragm a mouse and a chick biventer cervicis muscle. There were differences in both preparations, because the blockade effect of the concentration was more significant in the preparation of the mouse. It observed in the 100 ug/ml dose to total venom a indirect effect miotoxic in the preparation chick biventer cervicis. The importance of the isolation of the isoforms of BthTX-II Bj-IV and Bj-V are not restricted to the fact of having used optimized methodologies that guaranteed the biological function of these, being able to correlate the structure and function in this proteins family of great importance in the study of venom of snakes