Saccharification of sugarcane bagasse cellulosic pulp by cellulases and xylanases of Thermoascus aurantiacus

A proposta desse trabalho foi estudar o perfil de produção de enzimas hidrolíticas pelo fungo termófilo Thermoascus aurantiacus ATCC 204492 quando cultivado em resíduos agroindustriais e utilizá-las nas formas bruta ou purificada na hidrólise da polpa celulósica do bagaço de cana-de-açúcar. Para tanto, estudou-se a cinética de produção de xilanases e celulases em fermentação sólida, utilizando quatro diferentes tipos de resíduos agrícolas: bagaço e palha de cana-de-açúcar, palha de trigo e sabugo de milho. Os extratos obtidos foram investigados quanto ao teor de xilanase, endoglucanase, exoglucanase, β-glicosidase e β-xilosidase. A palha de cana-de-açúcar induziu as maiores atividades de xilanase em 9 dias (1679,8 UI/g) e de β-glicosidase em 6 dias (29,9 UI/g). Em sabugo de milho, o fungo produziu 46,0 UI/g de exoglucanase e 5,2 UI/g de β-xilosidase, em 17 dias. A maior produção de endoglucanase ocorreu em bagaço de cana-de-açúcar em 9 dias (108,9 UI/g). A carga inicial de inóculo foi avaliada para o meio preparado com bagaço e verificou-se que o aumento de 104 vezes no número de ascósporos influenciou somente a produção de exoglucanase, que teve sua atividade aumentada em 10 vezes. Após a determinação das atividades enzimáticas, o extrato de sabugo de milho foi aplicado em uma coluna trocadora de ânions, DEAE Sepharose CL6B, equilibrada em pH 3,5 e 6,0; a fim de se obter as enzimas em sua forma purificada. Pôde-se isolar uma xilanase, uma endoglucanase e uma β-glicosidase de massas molares 31,5 kDa, 32,4 kDa e 76,6 kDa, respectivamente. Os extratos enzimáticos do T. aurantiacus foram aplicados no bagaço de cana-de-açúcar in natura e na polpa celulósica do bagaço, obtendo 15 % de conversão enzimática da celulose (CEC), para ambos os substratos. Sendo assim, a polpa do bagaço de cana-de-açúcar foi pré-tratada com (1) proteases isoladas do abacaxi; (2) xilanase purificada de T. aurantiacus ou (3) ácido sulfúrico diluído. Em seguida foi feita a hidrólise do material pré-tratado com o extrato bruto de T. aurantiacus. O pré-tratamento com protease não teve efeito hidrolítico na polpa de bagaço, porém aumentou a CEC com as enzimas de T. aurantiacus de 9,4 % para 20,7 %. O pré-tratamento com a xilanase pura também não liberou açúcares redutores, contudo foi capaz de aumentar a CEC da polpa de bagaço para 30,0 %. O pré-tratamento com ácido diluído foi capaz de remover até 50 % da hemicelulose presente na polpa do bagaço, porém a remoção deste polissacarídeo não aumentou a CEC do bagaço com as enzimas de T. aurantiacus, mantendo o mesmo valor de CEC (15 %).The purpose of this work was to study the production profile of hydrolytic enzymes of the thermophilic fungus Thermoascus aurantiacus ATCC 204492 when cultivated in agroindustrial residues and to use them in the forms crude or purified for the hydrolysis of the cellulosic pulp of the sugarcane bagasse. For so much, it was studied the kinetics of xylanases and cellulases production on solid fermentation, using four different types of agricultural residues: sugarcane bagasse, sugarcane straw, wheat straw and corn cob. The extracts obtained were investigated for xylanase, endoglucanase, exoglucanase, β-glucosidase and β-xylosidase activities. Sugarcane straw induced the highest level of xylanase at 9 days (1679.8 UI/g) and β-glicosidase (29.9 UI/g) at 6 days. With corn cob, the fungus produced 46.0 UI/g of exoglucanase and 5.2 UI/g of β-xylosidase at 17 days. The highest endoglucanase production occurred on sugarcane pulp (108.9 UI/g) at 9 days. The initial load of inocullum was evaluated for sugarcane bagasse medium and it was verified that the 10000 times increase of ascospores had influence only in the exoglucanase production, showing a 10 fold increase of its activity. The corn cob extracts were applied in an ion exchange column, DEAE Sepharose CL6B, in order to purify cellulases and hemicellulases presents in the extracts. It could be isolated a xylanase, an endoglucanase and a β-glucosidase of 31.5 kDa, 32.4 kDa and 76.3 kDa, respectively. The enzymatic extracts of T. aurantiacus were tested on sugarcane bagasse in natura and on sugarcane bagasse pulp and 15 % of enzymatic conversion of the cellulose (CEC) was obtained from both substrates. A pretreatment of sugarcane bagasse pulp with (1) proteases isolated from pineapple; (2) xylanase purified of T. aurantiacus and (3) diluted sulfuric acid was performed. The pretreatment with protease did not present any hydrolytic effect on the sugarcane bagasse pulp, however it increased the final CEC with the enzymes of T. aurantiacus from 9.4 % to 20.7 %. The pretreatment with pure xylanase did not release sugars from pulp bagasse, however it was capable to increase the yield of the enzymatic hydrolysis of the pulp to 30.0 %. The pretreatment with diluted acid was capable to remove up to 50 % of the hemicellulose from the pulp, but CEC was maintained on 15 %