Analysis of modulatory factors involved in the phenotype of external genitalia virilization in females with classical form of 21-hydroxylase deficiency

A hiperplasia adrenal congênita (HAC) por deficiência da enzima 21-hidroxilase (21OH) é uma doença autossômica recessiva que compromete a síntese de cortisol e/ou aldosterona. É a causa mais frequente de distúrbio da diferenciação sexual 46,XX. Apresenta uma diversidade fenotípica, a qual é decorrente de mutações no gene CYP21A2. Observa-se forte correlação do comprometimento da atividade enzimática predita pelo genótipo com a forma de apresentação clínica e com os valores hormonais; entretanto, esta correlação não é observada com o grau de virilização pré-natal da genitália externa em mulheres com a forma clássica. Supomos que variações inter-individuais na ação, síntese e metabolismo dos andrógenos possam influenciar o fenótipo da virilização. Objetivos: avaliar se variantes alélicas em genes relacionados a ação, síntese ou metabolismo de andrógenos na vida fetal possuem um efeito modulatório na variabilidade fenotípica da virilização genital em mulheres com a forma clássica carreando genótipos 21OH semelhantes. Também serão avaliadas se diferenças na expressão tecidual local dos genes HSD17B5, SRD5A1, SRD5A2 e RA influenciariam esta variabilidade fenotípica da forma clássica. Casuística: foram selecionadas 187 mulheres com a forma clássica da HAC 21OH provenientes de 4 centros médicos. Dados clínicos, hormonais e o grau de virilização genital foram obtidos de forma retrospectiva da análise de prontuários. A intensidade de virilização genital foi classificada de acordo com a escala de Prader (P) e as pacientes foram divididas em 4 grupos: P I+II, P III, P IV e P V. As pacientes também foram agrupadas de acordo com o genótipo 21OH: grupo A carreadoras de mutações que predizem < 2% de atividade enzimática residual (n= 122) e grupo B carreadoras de mutações que predizem 3 a 7% de atividade residual (n= 58). Metodologias: foram amplificadas e re-sequenciadas as regiões que flanqueiam os exons dos genes CYP3A7, PXR e CAR. Para as variantes funcionais, foram re-sequenciados os exons 12-13 do POR e a região promotora do HSD17B5. As variantes V89L e A49T do SRD5A2 foram rastreadas por PCR-RFLP e o nCAG do RA por eletroforese capilar e análise pelo GeneScan. A determinação da expressão gênica em pele genital foi feita por PCR em tempo real utilizando os genes endógenos CYC, PGK1 e B2M. Os testes t-test, Mann-Whitney, Kruskal-Wallis, Fisher e regressão linear uni- e múltipla foram utilizados na análise estatística. Resultados: o Prader score no genótipo A variou de II a V (III: III IV) e no genótipo B de I a V (III: II - III) (P< 0,001). Foram encontradas em 2,5% dos alelos a variante CYP3A7*1C, em 24% CYP3A7*2, 31% rs2307424 CAR, 25% A503V POR, 33% -71G HSD17B5, 17% rs2518047 HSD17B5, 31% V89L SRD5A2 e em 1% dos alelos a variante A49T SRD5A2. Foi identificada associação das variantes rs2307424 CAR (P= 0,023 ;r2= 0,253) e rs2518047 HSD17B5 (P= 0,006; r2= 0,144) com o grau de virilização genital, tem sido encontradas em maior frequência no grupo de pacientes com virilização mais intensa. Todas as outras variantes não apresentaram associação com o Prader score (P> 0,05). As diferenças de expressão de todos os genes analisados em amostras de pele genital não foram estatisticamente significantes (P> 0,05), embora observou-se que em 4/7 amostras de pacientes com Prader score IV houve uma super-expressão do gene SRD5A2 em relação a 1/5 pacientes com Prader score III. Conclusão: neste estudo multicêntrico observamos que o genótipo 21OH se correlacionou com a intensidade de virilização genital em mulheres com a forma clássica. A variante rs2307424 do gene CAR, relacionada ao metabolismo pré-natal de andrógenos, e a variante rs2518047 do gene HSD17B5, relacionada à síntese de testosterona, associaram-se à fenótipos de virilização mais intensos. Não identificamos diferenças na expressão tecidual dos genes relacionados à síntese e/ou ação periférica de andrógenos em pacientes com os diferentes graus de virilizaçãoCongenital Adrenal hyperplasia (CAH) due to 21-hydroxylase deficiency (21OH) is an autosomic recessive disorder characterized by an impairment in the cortisol and/or aldosterone synthesis, being the most frequent cause of 46,XX disorder of sex development. The disease presents a wide phenotypic variability resulting from different CYP21A2 gene mutations and a strong correlation has been observed among genotypes, clinical forms and basal hormone levels. However, this correlation is not observed regarding the degree of prenatal external genitalia virilization in females and an interindividual variability in the synthesis, metabolism and/or peripheral action of androgens could corroborate for these findings. Objectives: to evaluate if allelic variants in genes related to the androgen synthesis, metabolism and peripheral action could modulate the genital phenotype in CAH females bearing similar CYP21A2 mutations. Differences in the HSD17B5, SRD5A1, SRD5A2 and RA gene expression in genital skin were evaluated among patients with different degrees of external genital virilization. Patients: were selected 187 CAH females and clinical and hormonal data were retrospectively evaluated. The degree of external genitalia virilization was classified according to Prader (P) scores and patients were divided into 4 groups: P I+II, P III, P IV and P V. Patients were also grouped according to 21OH genotypes: group A bearing mutations predicting < 2% of residual enzymatic activity (n= 122) and group B between 3 to 7% (n= 58). Methodology: the exonic flanking regions of CYP3A7, PXR e CAR genes were PCR amplified and sequenced. The exons 12-13 of POR and the promotor region of HSD17B5 were sequenced to screen the functional polymorphisms. The V89L and A49T SRD5A2 alleles were screened by PCR-RFLP and the CAG polymorphic tract of AR gene by capillary electrophoresis and GeneScan analysis. The differential gene expression in genital skin was evaluated by real time PCR and the CYC, PGK1 e B2M housekeeping genes were used. The t-test, Mann-Whitney, Kruskal-Wallis, Fisher and uni- and multiple linear regression tests were used in statistical analysis. Results: Prader score in group A varied from II to V (III: III - IV) and in group B from I to V (III: II - III) (P< 0,001). The CYP3A7*1C allele was identified in 2.5% of alleles, CYP3A7*2 in 24%, rs2307424 CAR in 31%, A503V POR in 25%, -71G HSD17B5 in 33%, rs2518047 HSD17B5 in 17%, V89L SRD5A2 em 31% and A49T SRD5A2 in 1% of alleles. The rs2307424 CAR (P= 0.023; r2= 0.253) and rs2518047 HSD17B5 variants (P= 0.006; r2= 0.144) were associated with the degree of external genitalia virilization, and they were found in a higher frequency in more virilized patients. The remaining variants were not associated with Prader scores (P> 0.05). The HSD17B5, SRD5A1, SRD5A2 and RA gene expressions did not significantly differ between patients presenting Prader score III and IV (P> 0.05); however, 4/7 samples from patients with Prader IV and just 1/5 patients with Prader III presented an increased SRD5A2 expression. Conclusion: In this multicentric study the 21OH genotypes were correlated with the degree of external genitalia virilization in CAH females. The rs2307424 CAR and the rs2518047 HSD17B5 variants, related to the prenatal androgen metabolism and synthesis, respectively, explained some of the interindividual variability of genital phenotype in CAH females bearing similar CYP21A2 mutations. Differences in the expression of genes involved in the peripheral androgen action did not corroborate for the variability of genital phenotype in CA