Production and immobilization of lipases produced by the endophytic fungus Cercospora kikuchii for biotechnological applications

O objetivo desse trabalho foi avaliar estratégias de imobilização de lipases produzidas pelo fungo endofítico Cercospora kikuchii através do uso de suportes não convencionais (subprodutos agroindustriais e quitosana). Investigou-se o uso de equipamentos de secagem (estufa, leito de jorro, leito fluidizado, liofilizador e \"spray dryer\") para desidratação dos derivados imobilizados obtidos. A imobilização por ligação covalente, usando glutaraldeído, epicloridrina e metaperiodato de sódio como agentes ligantes, apresentou valores para retenção da atividade enzimática superiores à imobilização por adsorção e encapsulação. Nos ensaios de imobilização utilizando glutaraldeído e secagem em leito de jorro, os melhores valores obtidos foram para a celulose microcristalina com retenção da atividade enzimática de 179,1%, seguido da casca de arroz 173,9%. A palha de milho foi o melhor suporte na imobilização covalente e secagem em estufa, com retenção de mais de 100% da atividade enzimática inicial. Na secagem por liofilização houve destaque para a casca de arroz (163,6%) seguida de palha de milho (157,2%) e cana de açúcar (154,6%). Utilizando quitosana como suporte e secagem em leito fluidizado, o valor para a retenção da atividade enzimática foi de 93,9% empregando-se o glutaraldeído como agente ligante. Na secagem do sistema quitosana-lipase em estufa a retenção da atividade enzimática foi de 68,2% e para secagem por liofilização esse valor foi superior a 80,0%. Realizou-se a caracterização dos materiais utilizados como suportes e estes apresentaram área superficial relativamente alta, elevada porosidade e estrutura constituída de macroporos. Estas características foram importantes por proporcionar a obtenção da enzima imobilizada com alta retenção da atividade catalítica. Alguns parâmetros bioquímicos e cinéticos da lipase na forma livre foram diferentes da lipase imobilizada. A alteração mais evidente foi a afinidade ao substrato (Km), que se mostrou dependente do protocolo de imobilização utilizado. Avaliou-se o potencial de aplicação biotecnológica dos derivados imobilizados que apresentaram maior retenção da atividade enzimática. Para a lipase imobilizada em casca de arroz o rendimento de transesterificação (produção de biodiesel) foi superior a 96,0% após 72 horas de reação enquanto que para as microesferas de quitosana esse valor foi atingido após 120 horas. Os produtos obtidos da transesterificação do óleo de coco estão de acordo com a especificação da Agência Nacional de Petróleo (ANP). Na avaliação da atividade de esterificação, a máxima concentração de butirato de butila foi obtida após 6 horas de reação, correspondendo a uma taxa de conversão de aproximadamente 99,0%, quando utilizou-se quitosana como suporte. Para o uso da casca de arroz, a máxima concentração de butirato de butila foi obtida também após 6 horas de reação, correspondendo a uma taxa de conversão de 92,5%. Este trabalho demonstrou que suportes de baixo custo permitiram a obtenção de derivados imobilizados com características semelhantes àqueles obtidos com o uso de polímeros sintéticos, os quais apresentaram excelente potencial para síntese de biodiesel e de butirato butila.The objective of this study was to evaluate strategies for immobilization of lipases produced by the endophytic fungus Cercospora kikuchii through the use of unconventional supports (agroindustrial by-products and chitosan). The use of different drying process (oven, spouted bed, fluidized bed, freeze drying and spray drying) for dehydration of immobilized derivatives obtained by adsorption, covalent binding and encapsulation was investigated. The covalent immobilization (using glutaraldehyde, epichlorohydrin and sodium metaperiodate as crosslinking agents) was the best process for the enzymatic activity retention. For covalent immobilization using glutaraldehyde and spouted bed drying, the best values were obtained for microcrystalline cellulose with enzymatic activity retention of 179.1%, followed by rice husk and corn straw with 173.9% and 169.8%, respectively. Corn stover was the best support in the covalent immobilization and oven drying, with retention 100.0% of the initial enzyme activity. For freeze-drying rice husk was the best support (163.6%) followed by corn stover (157.2%), sugar cane bagasse (154.6%) and corn cob (129.5%). Utilizing chitosan as support and fluidized bed drying, the value for the retention of enzymatic activity was 93.9% employing glutaraldehyde as activating agent. For chitosan-lipase drying using oven, the enzymatic activity retention was 68.2% and using freeze-drying the retention of enzymatic activity was higher than 80.0%. The support characterization was carried out and showed high surface area, high porosity and macropore structure. These characteristics were important for providing immobilized derivatives with high catalytic activity retention. Some biochemical and kinetic parameters of lipase in free form were different from the immobilized lipase. The most important changes was the substrate affinity (Km) which was dependent of immobilization protocol used. The last experimental part of this study was the biotechnological applications of the best immobilized derivatives produced. For the immobilized lipase onto rice husk the transesterification yield (biodiesel production) was above 96.0% after 72 hours of reaction while for the use of chitosan microspheres this value was reached after 120 hours. The viscosity values for the biodiesel samples are in accordance with specifications recommended by Brazilian Petroleum Agency (ANP) to be used as biofuel. The immobilized derivatives catalytic power was measured in terms of esterification activity too. The maximum concentration for butyl butyrate was obtained after 6 hours, corresponding to conversion rate of 99.0% when chitosan was used as support. Using rice husk, the maximum butyl butyrate concentration was obtained after 6 hours of reaction, corresponding to conversion rate of 92.5%. This work demonstrated that cheap supports are biocompatible with lipases, rendering immobilized derivatives with characteristics similar to or better than those previously obtained with synthetic polymers. The immobilized derivatives showed excelente potential for biodiesel production and butyl butyrate synthesis