Evaluation of the immunomodulatory properties of human mesenchymal stromal cells on HTLV-1 infected T lymphocytes

As características das células estromais mesenquimais multipotentes (MSC) podem ser influenciadas em microambientes inflamatórios. No entanto, o comportamento das MSC frente às infecções virais e a exata contribuição da infecção para disfunção das MSC continuam a ser elucidadas. Neste trabalho, avaliamos o efeito imunossupressor de MSC em linfócitos T infectados pelo HTLV-1 e a susceptibilidade da MSC à infecção por este retrovírus. Os ensaios de co-cultivo utilizando MSC e linhagens de linfócitos infectados pelo HTLV-1 resultaram em diminuição na expressão do gene viral tax e do antígeno p19 do HTLV-1. A redução na expressão do gene tax e da proteína p19 foi relacionada com a maior secreção de IL-6 e aumento na expressão dos genes PGE2, IDO e VCAM-1. Para confirmar a influência da imunorregulação das MSC sobre linfócitos T infectados, comparamos a proliferação de linfócitos T isolados de indivíduos infectados pelo HTLV-1 e indivíduos controles cultivados na presença de MSC. Foi observado que as MSC inibem a linfoproliferação de forma similar em amostras controle e na infecção pelo HTLV-1; e este efeito foi mediado pela expressão de PGE2 e IDO. Além disso, a expressão do gene pol e da proteína p19 do HTLV-1 foi menor após o co-cultivo com MSC, indicando que a imunorregulação pelas MSC também atua nas células infectadas pelo HTLV-1. Em seguida, para investigar as alterações provocadas pelo HTLV-1 nas MSC, realizamos análises morfológicas e ultraestruturais em MSC expostas ao HTLV-1 in vitro. Os resultados revelaram que o HTLV-1 induziu o aparecimento de vesículas intracelulares e a expressão das moléculas de superfície VCAM-1, ICAM-1 e HLA-DR. Os níveis de VCAM-1 e HLA-DR também foram mais expressos em MSC cultivadas na presença de PBMC isoladas de indivíduos HAM/TSP. O HTLV-1 não alterou o processo de diferenciação das MSC em osteócitos e adipócitos. No entanto, o contato direto in vitro das MSC com células infectadas pelo HTLV-1 proporcionou uma eficiente infecção das MSC. As partículas virais isentas de células não foram capazes de causar a infecção em MSC. Por fim, para certificar a existência biológica de MSC infectadas pelo HTLV-1, avaliamos a medula óssea de seis indivíduos acometidos por esta infecção. Foi observado um infiltrado de linfócitos T CD4+ na medula óssea de indivíduos HTLV-1+ e a análise do DNA proviral revelou a presença do provírus integrado nessas células T CD4+. O número de unidades formadoras de colônia fibroblastóide (CFU-F) foi menor em indivíduos infectados pelo HTLV-1 quando comparado com o grupo controle. A expressão dos marcadores de superfície e o potencial de diferenciação in vitro em adipócitos e osteócitos foram similares nas MSC obtidas de indivíduos HTLV-1 e indivíduos controle. Foi demonstrada a presença do DNA proviral e da proteína p19 do HTLV-1 nas MSC isoladas de pacientes HTLV-1+. A comparação do perfil de expressão gênica global entre MSC isoladas de HAM/TSP e indivíduos assintomáticos para o HTLV-1 revelou que os genes da catepsina B e da proteína ribossomal L10 foram diferencialmente expressos. Em conclusão, este trabalho demonstra a importância das MSC na imunomodulação de linfócitos infectados pelo HTLV-1 e que a infecção pelo HTLV-1 altera características biológicas das MSC.The characteristics of human multipotent mesenchymal stromal cells (MSC) can be influenced by the inflammatory microenvironment. However, the activity of the MSC against viral infections and the exact contribution of the infection to MSC dysfunction remain to be elucidated. We evaluated the immunosuppressive effect of MSC on HTLV-1 infected T lymphocytes and the susceptibility of MSC for this retroviral infection. Assays using co-culture of MSC and HTLV-1+ T lymphocyte lineages resulted in a decrease of tax gene expression and HTLV-1 p19 antigen. The reduction of the tax gene expression and the HTLV-1 p19 were associated with increased IL-6 secretion and higher PGE2, IDO and VCAM-1 gene expression. To confirm if MSC immunoregulation can influence the proliferation of HTLV-1 infected T lymphocytes, we compared the proliferation of HTLV-1+ individuals and healthy individuals cultured in the presence of MSC. It was observed that the lymphoproliferative inhibition by MSC in infected lymphocytes was similar to the control cells, and this effect was mediated by the expression of IDO and PGE2 genes. Furthermore, the pol gene and the HTLV-1 p19 protein were less expressed after co-culture assay with MSC, suggesting that the immunoregulation by MSC is effective in HTLV-1 infected T cells. In order to investigate the changes caused by HTLV-1 in MSC, we performed morphological and ultrastructural analysis of MSC exposed to HTLV-1 in vitro. The contact with HTLV-1 induced an increase of the intracellular vesicles, in addition the MSC cell surface molecules VCAM-1, ICAM-1 and HLA-DR were upregulated. The expression levels of VCAM-1 and HLA-DR molecules were increased in MSC cultured in the presence of PBMC isolated from HTLV-1 associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP) individuals. The MSC differentiation process into osteocytes and adipocytes was not impaired by HTLV-1. In addition, MSCs were efficiently infected by HTLV-1 in vitro due to the direct contact with the HTLV-1-infected cells. However, cell-free virus particles were not capable of causing productive infection. Finally, to ensure the biological function of MSC in HTLV-1 infected patients, we investigated bone marrow (BM) cells from HTLV-1 asymptomatic carriers (HAC) and HAM/TSP individuals. Initially, we observed an infiltration of CD4+ T-cell lymphocytes in BM from HTLV-1 infected individuals and the detection of provirus revealed HTLV-1 integration. The number of colonies of fibroblast progenitor cells (CFU-F) was lower in HTLV-1 infected individuals compared to control. HTLV-1 MSC isolated showed surface molecules expression and differentiation into adipogenic and osteogenic cells similar to control MSC. Proviral DNA and HTLV-1 p19 protein were detected in MSC from HTLV-1 patients. The comparison of global gene expression profiles between MSC isolated from HAM/TSP and HAC individuals revealed that cathepsin B and ribosomal protein L10 were differentially expressed. In conclusion, this study suggests the importance of MSC immunomodulation on HTLV-1 infected T lymphocytes and describe that HTLV-1 infects and alters the biological characteristics of MSC