Biological effects of ozone in water on dermal wound healing in rats

A ozonioterapia tem sido descrita como uma alternativa de tratamento para várias doenças por intervir possivelmente de forma favorável na reparação tecidual. A proposição desta pesquisa foi analisar os efeitos biológicos do ozônio diluído em água no processo de reparação tecidual, empregando duas concentrações diferentes. Foram realizadas feridas dérmicas padronizadas, com a utilização de punch, para excisão de fragmento da pele, com 5mm de diâmetro e profundidade, no dorso de 48 ratos. Os animais foram divididos em quatro grupos, conforme o tratamento realizado: em um grupo as feridas foram irrigadas com água ozonizada na concentração de 4ppm (GO3>), em outro foi utilizada água ozonizada na concentração de 1ppm (GO3<), no grupo controle positivo a água empregada não foi ozonizada (Gágua) e no controle negativo as lesões não receberam tratamento (Gnada). As irrigações foram realizadas durante dez minutos no trans-operatório e durante cinco minutos no pós-operatório diário, e os animais foram sacrificados nos períodos de 2, 7 e 14 dias. Nestes momentos, as feridas foram fotografadas para avaliação macroscópica, sendo que as imagens foram analisadas por software de morfometria (ImageLab2000®), e os espécimes foram processados para avaliação microscópica, em análise histomorfológica, histomorfométrica (por meio do mesmo software) e imunoistoquímica para anticorpo colágeno tipo-I e anti-actina. Todos os dados foram submetidos a estudo quantitativo e os obtidos pelo software também a estudo estatístico (Teste de Hipótese de Wilcoxon). Os resultados morfométricos demonstraram que, em 7dias, entre todos os grupos irrigados, o GO3< apresentou maior redução da área e que, no último período de observação, o GO3> apresentou contração da ferida mais regular, com diferenças estatisticamente significantes em comparação aos outros grupos. No período inicial de observação, a análise histomorfológica revelou que os GO3> e GO3< apresentaram expressão mais intensa do processo inflamatório, do que o grupo controle positivo, e demonstraram maior produção de matriz colagênica. No último período, em ambas análises histológicas, o GO3> e Gnada apresentaram de forma mais expressiva as características histológicas do tecido de granulação em formação, como expressão mais intensa de síntese de colágeno e formação de matriz colagênica mais organizada. As análises imunoistoquímicas revelaram que a marcação do colágeno tipo-I foi regular para todos os grupos, e que os grupos irrigados com água ozonizada apresentaram maior número de miofibroblastos. Provavelmente a capacidade do ozônio em interferir em reações bioquímicas celulares, bem como a maior quantidade de oxigênio proveniente da água ozonizada, podem estar relacionados aos eventos observados à reparação tecidual, que podem ser interpretados como favoráveis dependendo da situação clínica. Os resultados desta pesquisa sugeriram atuação do ozônio diluído em água na reparação das lesões teciduais, de forma dependente da dose, com possível favorecimento ao fechamento tecidual e provável estímulos inflamatórios e reparadores que favoreceram a síntese de tecido, sem produzir efeito tóxico ou prejudicial.The ozone therapy has been described as an alternative treatment for many diseases due to its action on tissue healing. The purpose of this research was to analyze the biological effects of ozonized water, in two different concentrations, on tissue healing. Standard dermical wounds were made with a punch to excise a skin fragment with 5 millimeters diameter and depth, in the back of 48 rats. The animals were divided in four groups according to treatment: in one group the wounds were irrigated with ozonized water at 4ppm (GO3>), in other group the wounds were irrigated with ozonized water at 1ppm (GO3<), in the positive control the water was not ozonized (Gwater) and in the negative control the wound did not received any treatment (Gnoun). The irrigations were realized during ten minutes in the transoperative time and daily, during five minutes, in the post-operative period. The animals were sacrificed on days 2, 7, and 14 following the procedure. At the time of sacrifice, the wounds were photographed to macroscopic assessment. The images were analyzed by morphometry software (ImageLab2000®) and the specimen were processed for microscopic, histomorfologic and histomorfometric (by the same software) analysis, and also for immunohistochemistry with antibody collagen type-I and anti-actyn. All data were submitted to quantitative analysis and the data got by the software were also submitted to statistic analysis (Wilcoxon Test). The morphometric analysis demonstrated that, in 7 days, among all groups, the GO3< group showed a bigger area reduction, and in the last period (14 days), the GO3> group showed more regular wound contraction; with statistically significant differences in comparison with the others groups. In the last period, the GO3> group showed a better shape factor (relation between area and perimeter) with statically significant differences in comparison to others groups. In the initial period of observation (2 days), the histomorphologic analysis revealed that the GO3> and GO3< groups showed more intense expression of inflammatory process than the positive control group, and also demonstrated increased production of collagen matrix. In the last period, for both histologic analyses, the GO3> e Gnoun showed more evident features of healing process, as such more intense expression of fibrils collagen and collagen matrix synthesis. The immunohistochemistry studies revealed that the collagen type-I scoring was regular for all groups and that the irrigated groups with ozonized water showed a higher number of miofibroblasts. Probably, the ozones capacity to interfere in biochemistry cellular reactions, as well the high oxygen quantity originated from ozonized water, may be related to tissue healing events, that may be favorable for some clinical situation. These results suggest that the ozonized water acts on tissue repair, in a dose dependent way, contributing to wound contraction and to tissue synthesis, without toxic effect