Anther culture and in vitro and in situ parthenogenesis of sweet orange (Citrus sinensis Osbeck.) genotypes

A produção de linhagens completamente homozigotas em programas de melhoramento genético de citros é difícil e demorada, e a obtenção de plantas duplo-haplóides pode ser utilizada para aumentar a eficiência de programas de melhoramento. No entanto, muitos são os fatores associados ao sucesso na regeneração de plantas haploides e/ou duplo-haplóides. Os objetivos deste projeto foram a obtenção de plantas haploides e/ou duplo-haplóides de laranja doce (Citrus sinensis) utilizando as técnicas de cultura de anteras e partenogênese in situ e in vitro, que consistem na obtenção e regeneração de embriões gaméticos a partir do desenvolvimento dos micrósporos e óvulos, respectivamente. Para tal, foram realizados estudos preliminares de biologia reprodutiva de C. sinensis, bem como a realização de trabalhos de cultura de anteras de laranja-doce, foram conduzidos testando-se aproximadamente 100 genótipos, além dos efeitos de tratamentos térmicos aplicados as anteras de laranja doce. Para os experimentos de partenogênese in situ foram testados os efeitos das doses de radiação aplicadas aos grãos de polens utilizados para a polinização e do uso de pólens de espécies consideradas distantes na obtenção de embriões e plantas haploides e duplo-haplóides de C. sinensis. Para a partenogênese in vitro foram testados os efeitos de meios de cultura na indução de embriogênese a partir de calos provenientes dos ovários. Os resultados obtidos permitiram a indução de calos, calos embriogênicos, e a regeneração de embriões a partir do cultivo in vitro de anteras. Também foi possível a seleção de genótipos mais responsivos a essa técnica e que permitirão a realização de trabalhos futuros para o processo de obtenção de plantas haploides e duplo-haplóides em laranja doce. Na maioria dos casos, os calos embriogênicos, embriões e plântulas obtidas da cultura de anteras foram diploides (2n) e molecularmente similares às plantas doadoras dos explantes. No entanto, houve a obtenção de um calo embriogênico, proveniente do cultivo de anteras de um híbrido (Citrus clementina x C. sinensis ,,Hamlin\"), que até o momento demonstrou um padrão de bandamento diferente e em homozigose para quatro conjuntos de primers microssatélites testados. A confirmação da ploidia e da origem gamética desse calo ainda é dependente da realização de análises com os embriões provenientes desses calos e de um maior número de marcadores moleculares. Nos experimentos de partenogênese in situ foram obtidos embriões e plântulas provenientes da polinização com polens irradiados, sendo identificadas plântulas com grande variação no nível de ploidia e com diferenças moleculares entre as progênies e os parentais, porém heterozigotas. A realização de cruzamentos com espécies distantes permitiram a obtenção de embriões e plântulas que apresentavam alta taxa de genes em homozigose, porém não em sua totalidade. Nas técnicas de partenogênese in vitro foi possível a obtenção de um protocolo para regeneração de embriões somáticos a partir de calos de ovários, no entanto, também não foram observadas a obtenção de plantas haploides e/ou duplo-haplóides. Os resultados obtidos confirmam a genótipo-dependência das respostas relacionadas à embriogênese gamética em Citrus, bem como do melhor entendimento dos aspectos reprodutivos de laranja doceThe production of completely homozygous lines in citrus breeding program is hard, and double-haploid plantlets (completely homozygous lines) can be used to improve these breeding programs. However, many factors are associated with the success of the regeneration of haploid or double-haploid plants. The aim of this study was the induction and regeneration of haploid and double-haploid plantlets from sweet oranges (Citrus sinensis) using the techniques of anther culture and in situ and in vitro parthenogenesis, that can result in the production of gametic embryos from microspores and ovules, respectively. To this, there were conducted preliminary studies with reproductive biology of C. sinensis, as well as, experiments with anther culture of more than 100 genotypes of sweet orange and the effects temperature treatments. To experiments of in situ parthenogenesis there were tested the effects of genotype, doses of radiation applied to the pollen grains, and also the use of pollen grains from distant species used in crossings with the aim of obtaining haploid and double-haploid embryos from sweet oranges. To in vitro parthenogenesis there was tested the effects of culture media in induction of embryogenesis from ovaries. The results showed the induction of callus and regeneration of embryos from in vitro anther culture and obtaining some responsive genotypes to anther culture, which will be useful in future works with induction and regeneration of haploid and double-haploid plants in sweet orange. The most of embryogenic callus and embryos obtained from anther culture were diploids (2n) and molecularly similar to the donor plants. However, one embryogenic callus obtained from anther culture of a hybrid (Citrus clementina x C. sinensis ,,Hamlin\") showed be different from donor plants and homozygous to four pair of microsatellite primers tested. Ploidy and the gametic origin confirmation of this embryogenic callus are still dependent of the analysis of a larger number of primers and the development and regeneration of embryos. In the in situ parthenogenesis experiments, the embryos and seedlings obtained from the pollination with irradiated pollen grains showed a larger variation of ploidy, determined by flow cytometric analysis. The analysis with molecular markers showed that these plantlets were different from the donor plants, but were heterozygous. The performance of crossings with distant species from Citrus sinensis results in production of embryos with a high rate of homozygosis, but not for all primers tested. In vitro parthenogenesis techniques shows be interesting to obtaining somatic embryos from ovary culture, however, no haploid or double-haploid embryos were obtained. The results confirm the genotype-dependent responses related to the gametic embryogenesis in Citrus, as well as, improve the knowledge about reproductive biology of sweet orang