Mapping and gene expression associated with the process of organogenic competence acquisition in tomato (Solanum lycopersicum L. cv Micro-Tom)

Dentre os fatores relacionados à capacidade superior de regeneração in vitro de Solanum peruvianum, está a presença do alelo dominante Rg1. O gene RG1, envolvido na formação de gemas caulinares a partir de raízes e outros explantes, foi mapeado no cromossomo 3 entre os genes BETA-CAROTENE HYDROXYLASE (CrtR-b) e PHYTOENE SYNTHASE (PSY1). Variações alélicas também são conhecidas para genes CrtR-b e PSY1. white flower (wf) é o alelo de CrtR-b que produz pétalas brancas e yellow flesh (r) é o alelo de PSY1 que produz frutos amarelos. Os alelos wf e Rg1 com r foram introgredidos na cultivar Micro-Tom (Solanum lycopersicum L). Através da transferência sequencial de explantes de SIM para MB e de RIM para SIM, verificou-se que MT-Rg1 reduz o tempo necessário para a indução de gemas em um dia (6 dias em SIM para MT), devido a redução no tempo necessário para a aquisição de competência em um dia (2 dias para MT). Foram obtidos 30 possiveis recombinantes advindos do cruzamento Rg1/rg1 Wf/wf x rg1/rg1 wf/wf, baseados nas características de pétala branca (efeito do alelo wf) e maior ramificação (efeito do alelo Rg1). Todos os possíveis recombinantes foram testados in vitro quanto à capacidade de formar gemas caulinares em SIM e raízes em RIM. Com isso, 7 linhagens recombinantes foram confirmadas e utilizadas para o mapeamento fino da região na qual o gene RG1 está localizado no cromossomo 3. Para o mapeamento foram testados marcadores do tipo CAPS e SCAR, sendo utilizado o DNA genômico extraído de S. pennellii, S. peruvianum, Micro- MsK, MT, MT-Rg1, MT-wf e das 7 linhagens recombinantes, constatando-se que alguns marcadores moleculares desenhados para S. pennellii podem ser utilizados para S. peruvianum. Estas análises também evidenciaram que o segmento de introgressão de MT-Rg1 está entre o marcador P5 e o gene CrtR-b, totalizando 136 genes, entre os quais GRAS 10 destacou-se como principal candidato para a função gênica de Rg1. Complementarmente, foi realizada a análise de RNA-Seq (plataforma SOLiD) para a identificação de genes diferencialmente expressos entre MT e MT-Rg1. Com isso, observou-se que existem mais genes regulados negativamente do que positivamente durante a aquisição de competência. Devido ao grande número de genes diferencialmente expressos, alguns parâmetros foram utilizados para classificar os genes que poderiam ser quantificados por qRT-PCR em um experimento de regeneração in vitro. Entre os 361 genes classificados, 5 foram selecionados para a quantificação de sua expressão. Destes 5 genes, GRAS 10 e Serine/threonine protein phosphatase 7 foram os que apresentaram-se mais positivamente expressos e aparentemente são os que estão mais intimamente ligados a fase de aquisição de competência. Como existem muitos genes GRAS, foi feita uma árvore filogenética para posicioná-lo e identificar genes homólogos a ele. Com base na análise filogenética foi possível identificar o gene GRAS 10 como homológo ao gene SCL8 já identificado em Arabidopsis. Porém, pouco se sabe a respeito de SCL8. Desse modo, ainda é necessário confirmar a identidade do gene RG1, o que possibilitará a compreensão do processo de aquisição de competência.The dominat allele Rg1 is related to the greater in vitro regeneration capacity of Solanum peruvianum L. The Rg1 gene is required for shoot formation from roots and others explants and was mapped on chromosome 3 between BETA-CAROTENE HYDROXYLASE (CrtR-b) and PHYTOENE SYNTHASE (PSY1) genes. Allelic variants are also known for the genes CrtR-b and PSY1. white flower (wf) is the allele of CrtR-b that produces white petals and yellow flesh (r) is the allele of PSY1 that produces yellow fruits. The alleles wf and Rg1 with r were introgressed into the Micro-Tom cultivar (Solanum lycopersicum L). Through the sequential transfer of explants from SIM to BM and RIM to SIM, we found that MT-Rg1 reduces the time required for the induction of shoots in one day (6 days on SIM for MT), due the reduction of the time required for competence acquisition in one day (2 days to MT). It was obtained 30 putative recombinants from crossing Rg1/rg1 Wf/wf x rg1/rg1 wf/wf. The recombinant lines were scored based on the presence of white petals (wf allele\'s effect) and increased shoot branching (Rg1 allele\'s effect). All putative recombinant lines were tested in vitro for their capability to form shoots in SIM and roots in RIM. Thus, 7 recombinant lines were selected and used to fine mapping the region where RG1 gene is located. CAPS and SCAR markers designed to S. pennellii were tested to fine-mapping, using as template genomic DNA samples from S. pennellii, S. peruvianum, Micro-MsK, MT, MT-Rg1, MT-wf and the 7 recombinant lines. These results confirmed that the molecular markers designed for S. pennellii can be successfully used for S. peruvianum. These analyzes also suggest that the introgressed segment of MT-Rg1 is located between the P5 marker and the CrtR-b gene. Within this region, there are 136 genes, including the GRAS 10 gene whichis the main candidate to RG1 gene function. In addition, we performed RNA-Seq analysis (SOLiD platform) to identify genes differentially expressed in MT and MT-Rg1. It was observed more down-regulated than up-regulated genes in the competence acquisition stage. Due to the large number of differentially expressed genes, some parameters were used for selection of genes that would have their expression validated by qRT-PCR in an in vitro regeneration test. Five genes among 361 genes differentialy expressed were selected to test their expression. Of these 5 genes, GRAS 10 and Serine / threonine protein phosphatase 7 were the most up-regulate genes and showed to be closely related to the stage of competence acquisition. Since there are many GRAS genes, we performed a phylogenetic analysis to identify homologous genes. Based on the phylogenetic analysis, GRAS 10 was identified as homologous to SCL8, a gene already identified in Arabidopsis. However, little is known about SCL8. Thus, it is still necessary to confirm the RG1 gene identity. This approach will provide a better understanding of competence acquisition process