Genetic transformation of yellow passionfruit for resistance to woodiness virus (Cowpea aphid-borne mosaic virus CABMV)

A cultura do maracujazeiro é afetada pela virose causada pelo Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), provocando a redução da qualidade e produtividade dos frutos e, em alguns casos, pode inviabilizar o cultivo comercial desta espécie. Uma alternativa para o controle de doenças viróticas é o desenvolvimento de plantas resistentes pela transformação genética. O objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas transgênicas de maracujazeiro (Passiflora edulis f. flavicarpa), utilizando 2 construções gênicas contendo a região codificadora do gene da proteína capsidial do CABMV. A construção pCABMV-asCP, que contém um fragmento na orientação antisenso e a construção pCABMV-dsCP, que contém fragmentos senso e antisenso do gene da proteína capsidial, separados por um íntron, uma construção hairpin. Para os experimentos de transformação genética, via Agrobacterium tumefaciens, foram utilizados os explantes de segmentos de hipocótilo e discos de folhas jovens das variedades FB-100, IAC-275 e IAC-277. Após 2 - 3 dias de co-cultivo em meio de cultura MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) contendo acetosseringona (100 mM), os explantes foram transferidos para meio de cultura de seleção e regeneração constituído de sais minerais e vitaminas de MS, suplementado com canamicina (100 mg/L) + cefotaxima (500 mg/L) + nitrato de prata (4,0 mg/L), pH 5,8 e os reguladores BAP, TDZ e combinação de BAP e TDZ. Após 4 - 6 semanas, as gemas adventícias desenvolvidas foram transferidas para meio de cultura de alongamento MSM + GA3 (1,0 mg/L) + cefotaxima (500 mg/L) + nitrato de prata (4,0 mg/L). As plantas desenvolvidas foram aclimatizadas e analisadas por PCR, utilizando-se primers específicos para a detecção dos transgenes. Foram identificadas 30 plantas transgênicas PCR positivas para do gene nptII, sendo 11 positivas para o fragmento antisenso da proteína capsidial do CABMV e 2 positivas para o fragmento da construção gênica hairpin. Até o momento, a integração dos transgenes foi confirmada por Southern blot em 4 plantas. Paralelo aos experimentos de transformação genética, foram avaliadas plantas de maracujazeiro das variedades IAC-275 e IAC-277, obtidas em experimentos anteriores, com a construção gênica pCABMV-CP, que contém o gene da proteína capsidial do CABMV. A análise de Southern blot de 14 plantas destes experimentos, confirmou a integração do transgene em 13 plantas, as quais foram propagadas e inoculadas mecanicamente com 3 isolados do CABMV (SP, RJ, CE). A linhagem T16 foi resistente as 3 inoculações, com os 3 isolados testados. Clones desta linhagem foram analisados por RT-PCR, comprovando a transcrição do transgeneThe yellow passionfruit is affected by Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), which causes a decrease in fruit quality and productivity and in some cases making it unpractical for commercial cultivation of this species. Ann alternative for the control of virus diseases is the development of resistant plants through genetic transformation techniques. The objective of this work was to obtain passion fruit (Passiflora edulis f. flavicarpa) transgenic plants with two different gene constructs derived from the CABMV coat protein coding region. pCABMV-asCP contains the gene fragment in an antisense direction and pCABMV-dsCP contains a sense and antisense coat protein gene fragments, separated by intron, a hairpin construct. The genetic transformation experiments with Agrobacterium tumefaciens, were done in hypocotyl segments and young leaf disks explants from varieties FB-100, IAC-275 and IAC-277. After two to three days in co-culture in MS culture medium (MURASHIGE; SKOOG, 1962) supplemented with acetoseringone (100 mM) the explants were subcultured to medium for selection and regeneration, composed of MS minerals and vitamins, supplemented with kanamycin (100 mg/L), cefotaxime (500 mg/L) and silver nitrate (4.0 mg/L), at pH 5.8, and the growth regulators BAP, TDZ and combination of BAP and TDZ. After four to six weeks, the adventitious buds developed were transferred to an elongating medium composed of MSM salts supplemented with GA3 (1.0 mg/L), cefotaxime (500 mg/L) and silver nitrate (4.0 mg/L). Plants were acclimatized and analyzed by PCR, with specific primers for the transgenes detection. Thirty transgenic plants were identified as PCR positive for the nptII gene, with 11 being positive for the antisense fragment of the CABMV coat protein gene and two positive for the hairpin gene construct fragment. Currently, the transgene integration was confirmed by Southern blot analysis in four plants. Simultaneously to the genetic transformation experiments, passionfruit plants, varieties IAC-275 e IAC-277, obtained from previous experiments with pCABMV-CP, which contains CABMV coat protein gene, were analized. The Southern blot analysis of 14 plants from these experiments confirmed the transgene integration in 13 plants, which were propagated and mecanically inoculated with three CABMV isolates (SP, RJ, CE). Line T16 was resistant to three inoculations with all three isolates tested. Clones from this line were analyzed by RT-PCR which confirmed the transgene transcriptio