In vitro citotoxicity test as an alternative to in vivo Draize test for the evaluation of cosmetic

Os procedimentos descritos por Draize são a base dos testes de irritação ocular e cutânea adotados internacionalmente para avaliar produtos e substâncias. Entretanto, eles têm sido criticados por motivos éticos, devido à crueldade com os animais e, por isso, metodologias alternativas têm sido estudas para avaliar a toxicidade de produtos que entram em contato com o ser humano. Sendo assim, um estudo comparativo foi realizado entre testes de irritação ocular, cutânea e mucosa oral usando coelhos e testes in vitro pelos métodos de difusão em ágar e de captura do vermelho neutro, ambos usando as linhagens celulares NCTC clone 929, FPC-IAL e SIRC. Os cosméticos avaliados foram batons, bases faciais, pós compactos, blushes, sombras para os olhos, máscaras para os cílios, lápis ou delineadores para os olhos, e sabonetes líquidos de uso adulto e infantil. Os testes in vivo e as linhagens celulares utilizadas no método de difusão em ágar foram escolhidas de acordo com o local de uso dos produtos, com exceção da linhagem NCTC clone 929 que foi utilizada na avaliação de todas as amostras. Das 204 amostras, 141 foram avaliadas pelo teste de irritação cutânea e linhagem FPC-IAL, 80 pelo teste de irritação ocular e linhagem SIRC e 78 pelo teste de irritação de mucosa oral e linhagem FPC-IAL. Somente as amostras de sabonetes líquidos foram avaliadas também pelo método de captura do vermelho neutro com as três linhagens celulares. Na avaliação in vitro as amostras foram analisadas em diferentes concentrações e o parâmetro observado foi viabilidade celular com o corante vermelho neutro. Os resultados obtidos permitiram observar que as amostras positivas no método de difusão em ágar que apresentaram até índice de zona 3 ou seja, halo de morte celular variando de 0,5 a 1,0 cm a partir da amostra, segundo a Farmacopéia Americana, não apresentaram irritação ocular, cutânea ou de mucosa oral. As amostras que apresentaram índice de zona 4, apresentaram diferentes graus de irritação ocular e cutânea com exceção de 2 sabonetes líquidos de uso infantil que não apresentaram reações in vivo, embora apresentaram citotoxicidade até a concentração de 10%. Este método apresentou correlação significante com o teste de irritação ocular, inclusive para os valores individuais da córnea e conjuntiva. Quanto ao método de captura do vermelho neutro obteve-se correlação significante para o teste de irritação cutânea e ocular, podendo inferir que quando as amostras de sabonetes líquidos apresentarem IC50 maior que 0,085% não irão induzir irritação cutânea e ocular nos coelhos. Não foi observada relação entre a origem das linhagens celulares usadas e o tecido alvo utilizado no teste in vivo, sendo que todas as linhagens mostraram correlação significante com a linhagem NCTC clone 929. De acordo com os dados, conclui-se que os métodos in vitro são mais sensíveis e que o método de difusão em ágar usando a graduação da Farmacopéia Americana, pode ser adotado como ensaio de triagem na avaliação de cosméticos. Isto resulta de sua capacidade de predizer a irritação, contribuindo significativamente para a redução dos testes que utilizam animais.The procedures described by Draize are the basis of both ocular and cutaneous irritation tests and have been adopted internationally for in vivo evaluation of products and substances. However, they have been criticized for ethical reasons, due to their cruelty towards animals. Therefore, alternative methodologies are being studied to evaluate the toxicity of products, which have contact with human beings. Thus, a comparative study was performed between ocular, cutaneous and oral mucosa irritation tests using rabbits and in vitro tests through agar diffusion method and neutral red uptake method, both with the use of NCTC clone 929, FPC-IAL and SIRC cell lines. Lipsticks, makeup base, face powder, blushes, eye shadows, mascara, pencils and eyeliners, as well as liquid soap for children and adult use were evaluated. The in vivo tests and the cell lines used in the agar diffusion test were chosen according to the place where the products are used. Only the NCTC clone 929 linage was used in the evaluation of all the samples. From the 204 analyzed samples, 141 were evaluated through the cutaneous irritation test and FPC-IAL lineage, 80 through the ocular irritation test and SIRC lineage, and 78 through the oral mucosa irritation test and FPC-IAL lineage. Only the samples of liquid soap were also evaluated through the neutral red uptake method with the three cells lines. The samples submitted to the in vitro evaluation were analyzed in different concentrations and the observed parameter was cellular viability with the use of neutral red. The results obtained revealed that the agar diffusion test positive samples which presented up to degree 3 zone rate, that is cellular death halo varying from 0,5 to 1,0cm from the samples, according to USP 25, didn’t provoke ocular, cutaneous or oral mucosa irritation. The samples which presented degree 4 zone also showed different degrees of ocular and cutaneous irritation, except to two units of liquid soap for children use which didn’t present in vivo reactions, although citotoxicity up to 10% concentration. This method showed significant correlation with the ocular irritation test and also concerning the individual values of cornea and conjunctiva. As for the neutral red uptake test, it presented significant correlation in the ocular and cutaneous irritation test, what make it possible to infer that when the liquid soap samples present IC50 above 0,085% they won’t cause ocular and cutaneous irritations in rabbits. No relation was observed between the origin of the cell lines and the target tissue used in the in vivo test, having all the cellular lines shown significant correlation with the NCTC clone 929 line. According to the data, the in vitro methods are more sensitive and the diffusion agar method, using the American Pharmacopeia graduation, can be adopted as a sorting procedure in the evaluation of cosmetics. This is a result of its capacity of predicting irritation, what largely contributes for the reduction of animal using tests