Development of artificial replicative plasmids for transformation of Mycoplasma pulmonis, M. capricolum and M. mycoïdes subsp. mycoïdes, and disruption of the M. pulmonis hemolysin A gene by homologous recombination

Os micoplasmas são os menores microrganismos capazes de autoreplicação conhecidos na natureza, responsáveis por uma série de doenças no homem e nos animais, infectando ainda plantas e insetos. Constituem um grande grupo de bactérias, ordenadas em diferentes gêneros na classe Mollicutes, cuja principal característica em comum, além do genoma reduzido, é a ausência de parede celular. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes SC, responsável pela Pleuropneumonia Contagiosa Bovina, foi o primeiro microrganismo desta classe de bactérias a ser identificado. Esta é uma doença bastante grave, com altas taxas de morbidade e mortalidade. A variedade Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes LC é responsável principalmente por casos de Pleuropneumonia Contagiosa Caprina, mastite no gado bovino, e ainda artrite em ovinos e caprinos em menor extensão. M. capricolum é um patógeno caprino, responsável principalmente por casos de artrite com grande importância econômica na medicina veterinária. M. pulmonis é um patógeno de roedores, considerado como o melhor modelo experimental para o estudo das micoplasmoses respiratórias. M. genitalium, o menor microrganismo conhecido capaz de se autoreplicar, é um patógeno humano responsável por casos de uretrite não gonocócica, cujo seqüenciamento completo do cromossomo tornou-se um marco na era da genômica. O estudo funcional do genoma destes micoplasmas, para a compreensão de sua biologia e patogenicidade, requer o desenvolvimento de ferramentas genéticas eficientes. No presente trabalho, análises in silico das seqüências na região das prováveis origens de replicação cromossômica (oriC) destes micoplasmas demonstraram a existência de possíveis DnaA boxes localizados em torno do gene dnaA. Estas regiões oriC foram caracterizadas funcionalmente após sua clonagem em vetores artificiais e a transformação dos micoplasmas com os plasmídeos recombinantes resultantes. O plasmídeo pMPO1, contendo a região oriC de M. pulmonis, sofreu integração no cromossomo do micoplasma por recombinação homóloga após poucas passagens in vitro. A redução desta oriC para o fragmento contendo somente os DnaA boxes localizados nas estremidades 5´ou 3´do gene dnaA não foi capaz de produzir plasmídeos replicativos em M. pulmonis, exceto quando estes dois fragmentos foram clonados no mesmo vetor, espaçados pelo determinante de resistência à tetraciclina tetM. Um fragmento interno do gene da hemolisina A (hlyA) de M. pulmonis foi clonado nestes plasmídeos oriC, e os vetores resultantes foram utilizados para transformar o micoplasma. A integração destes vetores por um crossing-over com o gene hlyA, causando a sua dirupção, foi documentada. Deste modo, estes plasmídeos oriC podem vir a se tornar ferramentas genéticas valiosas para o estudo do papel de genes específicos, notadamente aqueles potencialmente envolvidos na patogênese.Mycoplasmas are the smallest microorganisms capable of self replication known to date, responsible for many diseases in man and animals, infecting also plants and insects. They constitute a large group of bacteria, classified in different genera in the class Mollicutes, which main common characteristic, besides the small genome, is the absence of a cell wall. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes SC, responsible for the Bovine Contagious Pleuropneumonia, was the first microorganism of this class of bacteria to be identified. That is a quite severe disease, with high morbidity and mortality rates. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes LC is responsible mainly for cases of Caprine Contagious Pleuropneumonia, mastitis in cattle, and also arthritis in goats and sheep in less extension. M. capricolum is a pathogen of goats, responsible mainly by cases of arthritis with large economic impact in veterinary medicine. M. pulmonis is a rodent pathogen, considered to be the best experimental model for studying respiratory mycoplasmoses. M. genitalium, the smallest microorganism capable of self replication, is an human pathogen responsible for cases of non gonococcal urethritis, which complete chromosome sequencing has become a benchmark in the era of genomics. Functional studies of these mycoplasma genomes, for comprehension of their biology and pathogenicity, requires the development of efficient genetic tools. In the present work, in silico analysis of sequences of the putative origin of chromosome replication (oriC) region of these mycoplasmas demonstrates the existence of putative DnaA boxes located around the dnaA gene. These oriC regions were functionally characterized after cloning into artificial vectors and transformation of mycoplasmas with the resulting recombinant plasmids. The plasmid pMPO1, which contains the M. pulmonis oriC region, has integrated into the mycoplasma chromosome by homologous recombination after a few in vitro passages. Reduction of this oriC to the fragment containing only the DnaA boxes located upstream or downstream the dnaA gene could not produce plasmids able to replicate in M. pulmonis, except when these two fragments were cloned in the same vector, spaced by tetracycline resistance gene tetM. An internal fragment of the M. pulmonis hemolysine A gene (hlyA) was cloned into these oriC plasmids, and the resulting vectors were used to transform the mycoplasma. Integration of these disruption vectors by one crossing-over with the hlyA gene could be documented. Therefore, these oriC plasmids may become valuable genetic tools for studying the role of specific genes of mycoplasmas, specially those potentially involved in pathogenesis