Proteomics analysis of conventional and genetically modified varieties of soybean (Glycine max) aiming bioactive proteins

A soja tolerante ao herbicida glifosato é o vegetal geneticamente modificado mais cultivado. Entretanto, questões sobre a biossegurança dos alimentos GM são ainda levantadas, como as incertezas sobre a expressão das novas proteínas, mutações indesejadas, alterações de perfis nutricionais e aparecimento de compostos tóxicos. Apesar dos comprovados efeitos benéficos à saúde, a soja apresenta naturalmente, entre suas proteínas, fatores antinutricionais, que podem: provocar efeitos fisiológicos adversos; diminuir a biodisponibilidade de nutrientes; e induzir reações de hipersensibilidade. Paralelamente, a soja possui sabor e aroma desagradáveis por ação de enzimas lipoxigenases. Os fatores antinutricionais estão relacionados às aglutininas (lectinas) e aos inibidores de proteases (inibidor de tripsina, tipo Kunitz, e inibidor de tripsina e quimotripsina, tipo Bowman-Brik), enquanto as globulinas da soja respondem pelas reações de hipersensibilidade. Objetivou-se neste trabalho fazer a comparação dos mapas protéicos de soja GM, suas isolinhas convencionais e sojas orgânicas visando a detecção de alterações nos perfis protéicos destes diferentes tipos de cultivo, e também a análise da expressão dos fatores antinutricionais, como os inibidores de proteases e aglutininas, considerando a extensão das variações naturais existentes nas amostras. Para tanto, foram comparadas seis amostras de sementes de variedades comerciais de soja cultivadas em paralelo, sob as mesmas condições ambientais e de solo, compostas por três isolinhas genitoras e suas três correspondentes GMs e duas amostras orgânicas, sendo que uma delas é comercial e a outra ainda esta em campos de pesquisa, fornecidas pela Embrapa Soja. Foram analisados extratos protéicos de todas as amostras, após extração com ácido tricloroacético (TCA) e acetona, através de eletroforese unidimensional (1D) e bidimensional (2D). Nestas foi empregado gradiente de pH de 3-10 e as imagens avaliadas pelo software ImageMaster 2D Platinum. Diversos spots selecionados foram identificados por espectrometria de massas. Nas imagens dos géis 2D, foi possível identificar e quantificar os spots correspondentes às proteínas isoladas e não houve diferença estatística ao nível de significância de 5% entre os diferentes tipos de cultivo. Na verificação da sobreposição dos géis, obtivemos porcentagens de matchings superiores a 70% entre as amostras GMs e não GMs. As amostras orgânicas apresentaram % matchings menores que entre convencionais e GMs. Nos resultados da espectrometria de massas foi possível reconhecer os principais grupos protéicos da soja, como as frações e subunidades de β-conglicinina e de glicinina, bem como os inibidores de proteases, aglutininas e lipoxigenases e não foi possível perceber alterações na expressão dos peptídeos identificados e analisados. Podemos concluir que as variações encontradas entre as três amostras convencionais e entre as amostras dos grupos convencionais e orgânicas foram maiores que a comparação das amostras GMs com suas genitoras correspondentes.The glyphosate tolerant soybean is the most cultivated GM plant. However, questions about the bio-safety of GM foods are still rising, as there are uncertainty about the expression of new proteins, undesired mutations, changes in nutritional profile and the production of toxic compounds. Despite of the beneficial effects to human health, the soybean has anti-nutritional factors that can cause adverse physiological effects, reduce the bioavailability of nutrients, and induce hypersensitivity reactions. At the same time the soybean develop undesirable flavor due to the action of lipoxygenases. The anti-nutritional factors are related to agglutinins (lectins) and to the proteases inhibitors (Kunitz\'s Trypsin Inhibitor and Bowman-Birk\'s Inhibitor of Trypsin and Chymotrypsin) while the soybean globulins are responsible for hypersensitivity reactions. The objective of this work was to compare proteic maps of GM soybean, conventional isolines and organic soybean aiming to detect changes in protein profiles of the different types of cultivation and also analyze the expression of the anti-nutritional factors, such as protease inhibitors and agglutinins, taking into consideration the natural variation existing in the samples. For this, it was performed the comparisons between six seed samples of commercial varieties of soybeans, grown in parallel under the same environmental conditions and soil, composed of three parental isolines and their three corresponding GM and two organic sample, one of them is commercial and the other is still in search fields. The samples were provided by Embrapa Soja. Protein extracts were analyzed from the samples after extraction with trichloroacetic acid (TCA) and acetone using regular monodimensional electrophoresis (1D) and two-dimensional (2D) ones. For 2D were used strips of pH gradient 3-10 and the final images analyzed by ImageMaster 2D Platinum software. Several selected spots were identified by mass spectrometry. In the images of the 2D gels, we could identify and quantify the spots corresponding to proteins isolated and there was no statistical difference at 5% of significance between the different types of cultivation. Checking the overlap of the gels, we obtained matchings above 70% between GM and non GM sample. The organic sample had lower matching index between conventional and GM. It was possible to recognize the major groups of soy protein as a result of mass spectrometry such as¨β-conglycinin fractions and glycinin as well as protease inhibitors, lipoxygenase, and agglutinins. We concluded that the variations found among the tree conventional samples and between samples of conventional and organic groups were higher than the comparison of sample GMs with their corresponding parentals