Treatment of venous ulcers by low intensity ultrasound: assessment by image analysis and immunohistochemistry

Úlceras de perna acometem as extremidades dos membros inferiores e são causadas por alguma disfunção do sistema vascular. A cicatrização das úlceras é um processo dinâmico que envolve fenômenos biológicos, bioquímicos e imunológicos. A avaliação clínica da evolução das úlceras é difícil e se baseia nas modificações teciduais como granulação, fibrina/esfácelo e reepitelização. A avaliação clínico terapêutica adequada compreende da avaliação da área das úlceras e das áreas correspondentes aos diferentes tecidos presentes nas mesmas. Inúmeras são as opções terapêuticas objetivando a cicatrização das úlceras, envolvendo os mais variados estímulos imunobiológicos, sendo importante a avaliação imunohistoquímica da evolução do tratamento. Estudos anteriores demonstraram que o ultra-som de baixa intensidade (US) estimula a reparação tecidual de úlceras de perna. Com base nestes estudos esta investigação tem o objetivo de comparar a eficácia do ultra-som de baixa intensidade (30 mW/\'CM POT.2\') e de curativos diários á base de sulfadiazina de prata 1% na cicatrização de úlceras venosas, com as seguintes implementações: a) modificação da técnica de antissepsia para aplicação do ultra-som no tratamento das úlceras; b) padronização da técnica de captura da imagem das úlceras; c) utilização de nova técnica de quantificação do tratamento das úlceras e dos seus tecidos (granulação e fibrina/esfácelo) usando o software livre ImageJ para quantificar a área da úlcera e dos seus tecidos; d) quantificação dos fatores de crescimento TGF-\'BETA\' e VEGF e da enzima iNOS nas biópsias iniciais e no 45° dia do tratamento das úlceras. Nesta investigação foram tratadas dezesseis úlceras de perna do tipo venosa no Ambulatório de Úlcera da Dermatologia do Centro Saúde Escola (CSE) - HCFMRP - USP. Elas foram divididas em dois grupos experimentais: grupo 1 (7 úlceras) em que foi utilizado tratamento com curativos diários á base de sulfadiazina de prata 1%; grupo 2 (9 úlceras) em que foi utilizado tratamento com US 3 vezes por semana seguido de curativos diários com gazes umedecidas com soro fisiológico ou vaselina, conforme necessidade do paciente. Os pacientes tiveram um protocolo de 90 dias de tratamento e através de fotografias padronizadas as úlceras foram analisadas quantitativamente no início e a cada 15 dias de tratamento para o cálculo das áreas da úlcera, granulação e fibrina/esfácelo, através do ImageJ. Uma película de látex (preservativo) e gel no cabeçote do transdutor causa pequena atenuação no ultra-som e melhora a assepsia do tratamento das úlceras. A técnica de quantificação da cicatrização de úlceras através de análise de imagem pelo software ImageJ foi validada e comparada com técnicas convencionais de monitoramento do tratamento de úlceras. O cálculo da área das úlceras pelo ImageJ tem um erro médio de 4,8% mas não há diferença estatística, por método não paramétrico, nos resultados de quantificação pelo software quando comparado às técnicas convencionais ou quando são utilizados métodos padronizados e não padronizados de captura das imagens. Não há influência da segmentação manual das imagens das úlceras por diferentes usuários nos resultados das análises realizadas pelo ImageJ. Houve aumento, não estatisticamente significante, na presença da enzima iNOS e dos fatores de crescimento TGF\'BETA\' e VEGF nas úlceras tratadas por ultra-som. Houve uma aceleração estatisticamente significante na cicatrização das úlceras, na formação do tecido de granulação e na redução do tecido de fribrina/esfácelo do tratamento com ultra-som quando comparado ao tratamento com sulfadiazina de prata 1%.Chronic venous ulcers affect inferior members due to some vascular system disorders. The healing process is dynamic and involves biological, biochemical and immunological phenomenon. The clinical follow up is difficult and based on tissue alterations like fibrin, granulation and new epithelization. The therapeutic and clinical follow up should take into account the ulcer area as well as the area of the ulcer tissues. A large number of therapeutic procedures are available to heal ulcers and they are based on immunological stimulus which makes important to investigate the immunohistochemistry response of the treatment. Previous studies shown that low intensity ultrasound (US) stimulates the tissue repair of leg ulcers. The aim of this investigation is to compare the effectiveness of the US treatment with respect to dressings of silver sulfadiazine 1% on the healing of venous ulcers using a different methodology for carrying out what follows: a) the improvement of US treatment asepsis; b) the capturing of the ulcers image with a standardized method; c) the image analysis with a freeware software (ImageJ) to quantify the area of the ulcer and its tissues along the ulcer treatment; d) the quantification of the growth factors TGF-\'BETA\' e VEGF and the enzyme iNOS in biopsies taken on the first and 45th day of the treatment to assess the immunohistochemistry changes. In this investigation sixteen leg chronic venous ulcers were treated at the Ulcer Outpatient Clinic of Dermatology, Teaching Health Center, General Hospital, College of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo at Ribeirão Preto. The ulcers were randomly separated in two experimental groups: group 1, 7 ulcers were treated with daily dressings of silver sulfadiazine 1%; group 2, 9 ulcers were treated with low intensity ultrasound three times a week followed by daily dressings with humidified gauzes on physiologic sore or vaselin. The protocol last 90 days and photographs of the ulcers were taken every 15 days to quantify the area of the ulcer and its tissues (granulation and fibrin) through the ImageJ software. A thin layer of latex (condom) and gel cause a small attenuation of the ultrasound energy and improves the asepsis of the treatment. The image analysis technique using ImageJ was validated and compared with conventional methods of monitoring ulcers treatment. The calculation of the ulcers area by the ImageJ has an average error of 4,8%. There is no statistical difference in the results of monitoring ulcers treatment through this method and the conventional ones. The error of a standardized method for capturing the ulcers image did not show statistical difference when compared to a nonstandardized method. The manual segmentation of the ulcer image by different users do not influence the results of the image analysis by the ImageJ. The increase in the enzyme iNOS and growth factors TGF\'BETA\' and VEGF in the ulcers treated by US is not statistically significant. There is a statistical significance in the treatment of ulcers by US when compared to dressings of silver sulfadiazine 1% with respect to area decrease and the formation of granulation and fibrin tissues. The low intensity ultrasound accelerates the healing process of the ulcers