Physico-chemical and structural characterization of SbKI, an inhibitor of serine proteases from Stryphnodendron barbatiman seeds

Os inibidores de proteases desempenham nas plantas funções como: defesa contra ataque de predadores de sementes, regulação de enzimas endógenas e fontes de proteínas e aminoácidos. Muitos destes inibidores são utilizados em estudos bioquímicos, bem como no tratamento de patologias humanas como inflamação e câncer. Neste trabalho, um inibidor de serinoprotease, presente na semente de Stryphnodendron barbatinan (barbatimão), foi purificado, caracterizado e denominado SbKI. Sementes de barbatimão maduras foram trituradas, até a obtenção de uma farinha, e esta foi suspensa em PBS, pH 7,4 (1 :5 m/v), sob agitação por 14 horas a 4°C. O extrato foi centrifugado, filtrado e tratado com PVPP, sendo denominado EB, o qual apresentou inibição da coagulação sanguínea e da atividade de algumas serinoproteases. O inibidor SbKI foi purificado utilizando-se três procedimentos cromatográficos: cromatografia de exclusão molecular (Superdex-75, 10/30), troca iônica (Mono-S HR, 5/5), ambas acopladas em um sistema &TA Purifier e fase reversa (C-18, Waters 250 x 4,6mm) acoplada a um sistema HPLC. Em cada etapa de purificação a presença do inibidor foi monitorada pelos testes de atividade inibitória da tripsina e da coagulação, ambos in vitro. SDS-PAGE, sob condições redutoras, mostrou que o inibidor é formado por duas cadeias polipeptídicas (cadeia pesada e leve) unida por ligação dissulfeto. As cadeias foram separadas pela cromatografia de &se reversa após serem reduzidas e alquiladas. Suas seqüências N-terminais foram determinadas pela degradação de Edman, em seqüenciador automatizado, apresentando alta identidade seqüencial com inibidores do tipo Kunitz de outras leguminosas. A determinação da massa/molecular do inibidor e de suas cadeias isoladas, foram determinadas por espectroscopia de massa (LCtESI-MS system) mostrando massas moleculares de 19.570Da7 15530Da e 4040Da, respectivamente. A espectroscopia de dicroísmo circular (CD) revelou que o inibidor é formado predominantemente por elementos beta e estruturas desordenadas. SbKI foi estável a variações de pHs (2-12) e temperaturas extremas e a temperatura de transição foi calculada em 73,3\" C. A determinação das constantes de inibição (KI) foi realizada para as serinoproteases tripsina (KI = 5,5 nM) e calicreína plasmática (KI = 1,l nM).Proteinase inhibitors perform many beneficia1 roles in plants such as defense against the attack of seed predators, regulation of endogenous enzymes and sources of proteins and amino acids. Many inhibitors are used in biochemistry research, as well as human pathology treatment such as inflammation and cancer. In this work, a serino proteinase inhibitor found in Stryphnodendron barbatiman seeds (barbatimão) was purified, characterized and denoted SbKI. Mature barbatimão seeds were ground and suspended in PBS pH 7.4 (15 wlv) and stirred for 14 hours at 4OC. The suspension was centrifuged, filtered and treated with PVPP and denoted EB. This EB inhibited blood coagulation and some serine proteinases activities. The inhibitor SbKI was purified by three chromatography step: molecular exclusion (on Supredex-75, 10/30), ion exchange (on Mono-S, 5/5), both connected to AKTA Purifíer System and reversed phase (on C-18, Waters 250 x 4.6 mm) connected to HPLC System. In each purification step the presence of inhibitor was monitored, in vitro, by trypsin and coagulation inhibitory activity. SDS-PAGE, reduced conditions, showed two polypeptide chains (heavy and light chains) linked by one disulphide bridge. The chains were separated by reversed phase chromatography aíter reduced and alquilated. The N-terminal sequence were performed on automated protein sequencer by Edman degradation and showed homology with Kunitz type inhibitors from Leguminosae. Molecular weight of inhibitor and its chains were determined by mass spectrometry (LC/ESI-MS System) and showed molecular weight of 19.570Da, 15.530Da and 4040Da, respectively. Circular dichroism spectroscopy showed SbKI is constituted predominantly by P elements and unordered structures. SbKI was stable over extreme ranges of pH (2-12) and temperature and the transition temperature 73.3\"C investigated by CD and fluorescence emission spectroscopies. Inhibition constants (Ki) were determined by typsin (Ki = 5.5 nM) and human plasmatic kallikrein (Ki = 1.1 mM