Biochemical and biophysical studies of metalloproteinases/disintegrins from snake venom

Metaloproteases/desintegrinas (MD) isoladas de venenos de serpentes são potentes inibidores de agregação plaquetária e de adesão celular, processos envolvidos em doenças como trombose e câncer. As MD pertencem a classe PIII das SVMPs (´snake venom metalloproteinases´) que são constituídas por três domínios: metaloprotease (M), tipo-desintegrina (D) e rico em cisteína (C). A função dos três domínios nas atividades das moléculas ainda não é totalmente conhecida, e estudos com o objetivo de esclarecer suas funções são importantes para o desenvolvimento de novos fármacos. Algumas proteínas da classe PIII apresentam elevada atividade auto-proteolítica (liberando peptídeo constituído dos domínios D e C) enquanto que em outras PIII esta atividade não é menos evidente. Neste trabalho nós estudamos MD isoladas de veneno de Bothrops jararaca (bothropasina) e Bothrops alternatus (alternagina) em relação aos seus processos de autólise. Alternagina e bothropasina apresentaram diferentes comportamentos em relação à auto-proteólise, apesar do elevado grau de identidade entre as duas moléculas. Nesse trabalho, caracterizamos a estabilidade química e o comportamento de desenovelamento da proteína alternagina nativa pela guanídina HCl usando emissão de fluorescência intrínseca em combinação com espectroscopia de dicroísmo circular ´far´-UV. As amostras de alternagina, purificadas do veneno liofilizado, foram monitoradas por dicroísmo em comprimento de onda de 220nm e os resultados mostraram estruturas intermediárias no processo de desnaturação da proteína. Estudos semelhantes foram feitos com a bothropasina, com o objetivo de relacionar seus diferentes comportamentos auto-proteolíticos com os processos de desnaturação. Nas duas proteínas ocorreu uma alta correlação entre os estudos de auto-proteolise e de desnaturação. As MD isoladas de B. jararaca, jararagina e bothropasina, são isoformas descritas na literatura como isoláveis através de diferentes cromatografias. Neste trabalho, utilizamos os diferentes protocolos descritos para verificar a porção da isoforma majoritária no veneno. As amostras de proteína serão analisadas por espectrometria de massas, uma vez que a região N-terminal das proteínas está bloqueada.Metalloproteinases/disintegrin (MD) isolated from snake venom are potent inhibitors of platelet aggregation and cell adhesion, processes involved in illnesses as cancer and thrombosis. MD belong to the PIII class of the metalloproteinase/disintegrin gene family and they are constituted by three domains: the catalytic domain, metalloprotease; disintegrin-like (D) and cysteine-rich (R). Some MD proteins are rapidly processed (producing the disintegrin-like/ cysteine-rich domains), while others MD are processed slowly. In this work, we studied the autolysis process of the MD isolated from the venom of Bothrops jararaca (bothropasin) and Bothrops alternatus (alternagin). Despite high sequence identity, alternagin and bothropasin showed different autolysis processes. The processing of the alternagin produces an intermediate with molecular mass of 43kDa whereas in the processing of the bothropasin this intermediate is almost not observable. In this work we studied alternagin and bothropasin under the viewpoint of chemical stability and the unfolding process to guanidine hydrochloride (Gnd-HCl) using dichroism circular and fluorescence spectrometry. The CD spectra (220nm) of the alternagin purified from the lyophilized venom showed an intermediate structure in the unfolding process. These studies were performed on bothropasin with the goal to relate the autolysis and unfolding process. These studies revealed a high correlation between both proteins . The MD isolated from B. jararaca, jararagin and bothropasin, are isophorms purified from different chromatograph processes reported in the literature. In this work, different purification processes were used to check the major isophorm. Due to the blocked N-terminal region, these proteins will be assessed by mass spectrometry