STRUCTURAL STUDIES OF THE HUMAN SEPTIN SEPT11

Septinas são proteínas de ligação ao nucleotídeo de guanina (GTP). Foram inicialmente identificadas em fungos e atuam na fase final da divisão celular. Posteriormente, também verificaram que esta família de proteínas está presente em outros eucariotos com exceção de plantas. Septinas são purificadas de fungos Saccharomyces cerevisiae, Drosophila e cérebro de mamíferos na forma de heterofilamentos e são constituídas de três regiões principais: um N-terminal variável, um domínio central GTPase altamente conservado e um domínio coiled-coil C-terminal. Sabe-se que existem pelo menos catorze genes que codificam septinas em humanos, no entanto, há poucas informações estruturais sobre elas. Destas catorze septinas, somente três (septinas 2, 6 e 7) tiveram parte de suas estruturas cristalográficas determinada, principalmente os domínios GTPase. A família das septinas pode ser dividida em quatro subgrupos baseado em similaridade seqüencial. Um deles (grupo II) é formado por SEPT6, SEPT8, SEPT10, SEPT11 e a recém-descoberta SEPT14. A proteína SEPT11 foi descrita pela primeira vez em 2004 e detectada em vários tecidos humanos. Faz parte de complexos com outras septinas na formação de heterofilamentos e pode estar envolvida no transporte tubular e filtração glomerular nos rins. Para apresentar os estudos com a proteína SEPT11 nós a dividimos em domínios estruturais: SEPT11NG (domínios N-terminal e GTPase), SEPT11G (domínio GTPase), SEPT11GC (domínios GTPase e C-terminal) e SEPT11NGC (domínios N-terminal, GTPase e C-terminal). Os genes dos domínios estruturais SEPT11G e SEPT11GC foram clonados em vetor de expressão bacteriano, e SEPT11NG em vetor de propagação bacteriano. Tanto SEPT11G quanto SEPT11GC foram produzidos em E. coli e purificados com sucesso. O espectro de dicroísmo celular (CD) e o emprego de técnicas computacionais mostraram que a SEPT11 apresenta um perfil característico de proteínas do tipo &#945/&#946 coerente com a estrutura observada para SEPT6. Os estudos de espalhamento de luz a 350 nm mostraram que a proteína sofre um forte processo de agregação em temperaturas maiores que 30&#176C, parecido com outras septinas (incluindo SEPT4 e SEPT2) e condizentes com estudos de estabilidade térmica acompanhados por CD. Resultados de cromatografia de exclusão molecular indicam que SEPT11G foi produzida na forma de um homodímero (como também visto para SEPT4, SEPT2 e SEPT7) e SEPT11GC na forma de um monômero. Todos estes dados sugerem que as proteínas heterólogas descritas aqui enovelaram corretamente e assumiram sua estrutura nativa. Porém também foi demonstrado que a SEPT11G não apresentava nenhum nucleotídeo ligado (GDP ou GTP) mesmo quando purificada na presença dos mesmos. Resultados de modelagem da SEPT11G baseado no domínio GTPase da SEPT6 não revelaram nenhuma diferença significativa em torno do sítio ativo capaz de explicar a incapacidade da SEPT11 em ligar GTP/GDP. Especulamos que no caso da SEPT11 (e possivelmente outras septinas do grupo II), a presença de outras septinas e a montagem do heterofilamento sejam necessárias para estabilizar a interação entre GTP e a proteína.Septins are GTP-binding proteins. They were originally identified in fungi and act during the final stages of cell division. Subsequently, they were also identified in other eukaryotic with the exception of plants. Septins are purified from Saccharomyces cerevisiae, Drosophila, and mammalian brain in the form of heterofilaments and consist of three principal regions: a variable N-terminal domain, a central highly conserved GTP-binding domain and a coiled-coil domain at the C-terminus. It is known that there are at least 14 human septin genes but as yet, there is still relatively little structural information concerning their protein products. Of these, only three (septins 2, 6 and 7) have had part of their three-dimensional structure (principally the GTPase domain) determined by X-ray crystallography. The septin family can be divided into four subgroups on the basis of sequence similarity. One of them (group II) is composed of SEPT6, SEPT8, SEPT10, SEPT11 and SEPT14. SEPT11 was described for the first time in 2004 and was observed to be expressed in several human tissues. It is described as forming part of heterofilamentous complexes with other septins and may be involved in the glomerular filtration in the kidney. In order to characterize the SEPT11 protein, it was initially divided into its component structural domains and several constructs elaborated: SEPT11NG (N-terminal and GTPase domain), SEPT11G (GTPase domain), SEPT11GC (GTPase domain and C-terminal) and SEPT11NGC (N-terminal, GTPase and C-terminal domains). The genes corresponding to SEPT11G and SEPT11GC were cloned in an expression vector and SEPT11NG into a bacterial propagation vector. Both SEPT11G and SEPT11GC were successfully produced in E. coli and subsequently purified. Both circular dichroism spectra and computational techniques indicated that SEPT11 exhibited that both proteins were of the &#945/&#946 type, as anticipated, coherent with the structure of SEPT6. Light scattering measurements at 350 nm showed that the protein undergoes a process of aggregation at temperatures above 30&#176C, similar to other septins (SEPT2 and SEPT4) and consistent with thermal stability studies using circular dichroism. Results of size exclusion chromatography indicated that SEPT11G formed dimers (similar to SEPT2, SEPT4 and SEPT7) and SEPT11GC apparently formed monomers only. All of these experimental data suggest that the heterologously expressed proteins described here folded into their native conformation. On the other hand, we also demonstrated that SEPT11G was nucleotide free even when purified in the presence of excess GTP or GDP. Homology modeling of the GTPase domain of SEPT11 failed to reveal any significant differences with respect to SEPT6 which would explain this lack of binding activity. We speculate that in the case of SEPT11 (and possibly other members of the group II septins) the presence of partner septins and the formation of the heterofilaments are essential for stable nucleotide binding