Celular passage, sex and X-specific transcription interfere in bovine nuclear transfer embryo and fetal development

Células cultivadas por longos períodos acumulam alterações genéticas e epigenéticas que resultam frequentemente em uma inapropriada reprogramação nuclear de embriões submetidos à transferência nuclear a partir de células somáticas (TNCS). Além disso, a variável sexo é um fator limitante na produção de blastocistos e na competência de desenvolvimento pós-implantação de embriões produzidos in vitro. Desta maneira, o objetivo deste trabalho foi estudar o efeito do número da passagem nos experimentos de transferência nuclear, bem como, avaliar o efeito do sexo no desenvolvimento in vitro e no potencial pós-implantação destes embriões. Para tanto, oócitos derivados de matadouro foram enucleados e reconstruídos com células somáticas de animal adulto a partir de 18 horas pós-maturação. Após a fusão (dois pulsos de 2,25 kv/cm durante 65 µseg) e ativação química (ionomicina - 5,0 µM durante 5 minutos e 6-DMAP - 2,0 mM durante 3 horas), os zigotos reconstituídos com núcleo de célula somática foram cultivados em CR2 com monocamada de células da granulosa a 38,8ºC, em atmosfera umidificada e 5% de CO2 em ar durante 7 dias. Os resultados foram analisados utilizando o teste Qui-quadrado (X2). No cultivo in vitro, embriões reconstruídos com células em passagens tardias apresentaram menores taxas de clivagem, 8 células e desenvolvimento a blastocisto (p < 0,05). Embriões reconstruídos com células em passagens iniciais apresentaram maior competência em formar um blastocisto (16% versus 14% - intermediárias e 7% - tardias; p < 0,05). Apesar dos embriões reconstruídos com células em passagens tardias apresentarem resultados semelhantes de prenhez aos 30 dias (35% versus 27% - iniciais e 26% - intermediárias), não foram competentes para o desenvolvimento de uma gestação a termo (0% versus 34% - iniciais e 25% - intermediárias). Além de não apresentarem diferenças nas taxas de desenvolvimento a termo, neonatos produzidos com células em passagens iniciais e intermediárias apresentaram taxas equivalentes de sobrevivência (50% vs 57%, respectivamente). Em relação ao sexo, embora maior taxa de clivagem tenha sido observada para fêmeas (78% vs 74%; p < 0,05), embriões machos foram mais competentes no desenvolvimento a blastocisto (16% vs 14,5%; p < 0,05). As taxas de prenhez, desenvolvimento a termo e sobrevivência foram semelhantes entre os gêneros. Entretanto, fêmeas apresentaram maior taxa de aborto entre 90 e 120 dias de gestação (p < 0,05). Em conclusão, estes resultados indicam que células doadoras de núcleos cultivados por um longo período dificultam a produção de blastocistos e aumentam as chances de perdas durante a gestação. Também foi possível concluir que embriões clonados do gênero masculino apresentam maior competência para desenvolver a blastocisto e suportar uma gestação a temo.Cells cultured for long-term periods accumulate genetic and epigenetic modifications that result in improper nuclear reprogramming of somatic cell nuclear transfer (SCNT) embryos. Furthermore, the sex may be a limiting factor in blastocysts production and in post-implantation developmental competence. Therefore, the objective of this study was to determine the effect of the passage number for SCNT, and to evaluate the effect of sex on in vitro development and on post-implantational competence of these embryos. Oocytes obtained from slaughtered cows were enucleated and reconstructed by TNCS from an adult animal at 18 hours of in vitro maturation. After fusion (two 2.25 kv/cm DC pulses for 65 µsec) and chemical activation (5.0 µM ionomycin for 5 min followed by 2.0 mM 6-DMAP for 3 hours), the reconstructed zygotes were cultured in CR2 on a granulosa cell monolayer at 38.8ºC in a humidified atmosphere of 5% CO2 in air for 7 days. Data were analyzed using Chi Square analysis. Reconstructed embryos with cells on late passages showed lower rates for cleavage, 8 cells embryos and blastocyst formation (p < 0.05). Reconstructed embryos with cells on early passages showed higher competence to blastocyst formation (16% versus 14% - intermediate and 7% - late; p < 0.05). Although reconstructed embryos with cells on late passages showed similar results for pregnancy on day 30 (35% versus 27% - early and 26% - intermediate), they were not competent to develop to term. Calving rates and perinatal survival (PNS) were similar when comparing early and intermediate passages (34% vs 25% and 50% vs 57%, respectively). Regarding sex, although cleavage rates were higher for female embryos (78% vs 74%; p < 0.05), male embryos were more competent for blastocyst formation (16% vs 14.5%; p < 0.05). The pregnancy rate, development to term and PNS were similar between gender, however, female embryos showed higher rates of abortion between day 90 and 120. In conclusion, these results indicate that long-term culture of donor cells decrease blastocyst formation and increase the chances of failure during pregnancy. Futhermore, cloned male embryos were more competent to form a blastocyst and had lower rates of abortion