Action of photosensitizers dyes in homogeneous and liposomal microheterogeneous medium to control Streptococcus mutans growing

Desequilíbrios no desenvolvimento da microbiota bucal podem gerar algumas patologias e, entre elas, está a cárie dental, uma doença crônica - contagiosa, de etiologia multifatorial, mas extremamente relacionada à bactéria Streptococcus mutans, que através de seu metabolismo fermentativo destrói estruturas mineralizadas do dente. Além disso, o aumento da resistência à antibioticoterapia, devido à existência do biofilme (também formado pelo S. mutans) e aos tratamentos bactericidas mal sucedidos, faz do desenvolvimento de técnicas antimicrobianas alternativas um importante foco nesta área de pesquisa. Assim, na busca de novas metodologias contra microrganismos, estudos usando a Terapia fotodinâmica (TFD) têm sido empregados para se obter a inativação de bactérias como o S. mutans. A TFD é uma modalidade terapêutica em que há a integração de uma luz visível, um corante e oxigênio que quando interagem, levam à produção de diferentes espécies reativas de oxigênio (ERO?s) que irão desencadear uma seqüência de eventos biológicos, resultando numa possível morte ou inativação celular, inclusive de microrganismos como o S. mutans. O objetivo deste trabalho foi avaliar a ação da TFD sobre a bactéria S. mutans em meio planctônico ou formando biofilme. Assim, a metodologia padronizada possibilitou o cultivo da bactéria em meio líquido (planctônico) ou na forma de biofilme, tornando-se possível a realização de testes com a aplicação da terapia fotodinâmica. Uma análise das curvas de crescimento possibilitou avaliar o metabolismo anaeróbico de S. mutans que consome açúcares fermentáveis (glicose, frutose, sacarose e maltose), mostrando-se hábil na produção de ácidos. Conforme proposto, um fotopolimerizador de resina odontológica foi empregado como fonte de luz na TFD. Esta luz é emitida em comprimentos de onda variáveis (possível graças à troca do filtro de luz do equipamento) que fotoativam os diferentes corantes empregados tais como: Rose bengal, a Protoporfirina IX (PPIX) e a Zinco ftalocianina. Estes agentes fotossensíveis, depois de irradiados, produzem espécies reativas de oxigênio, principalmente o oxigênio singlete, que leva à inativação bacteriana observada nos experimentos realizados. Em contrapartida, as concentrações de luz e corantes empregados na inativação bacteriana apresentaram valores de baixa toxicidade para culturas de fibroblastos. Além disso, a grande diferença entre as concentrações de corante que causa a morte da bactéria na presença e na ausência de luz, indica que os compostos produzidos pela fotoativação são os responsáveis pela morte bacteriana em meio planctônico. Quanto ao biofilme formado por S. mutans, é possível promover uma diminuição da sua formação tanto com a TFD quanto com o emprego de flúor. Células irradiadas imediatamente após a adição do corante foram semelhantemente inativadas após TFD, podendo ser desconsiderada uma incubação prévia para que agente fotossensível fosse homogeneamente distribuído. Aparentemente a TFD não acarretou em mudanças na atividade ATPase total extraída da membrana da bactéria. Os experimentos para a determinação da localização dos corantes na célula ou para a avaliação de sua capacidade acidogênica não foram conclusivos em relação à possibilidade das espécies reativas estarem causando danos à parede, membrana plasmática ou ainda em alguma biomolécula citoplasmática da bactéria. Em adição, os estudos da peroxidação lipídica, de análise do DNA e de proteínas de stress após a TFD não trouxeram nenhuma informação adicional conclusiva sobre o alvo específico das ERO?s que causam a inativação bacteriana. Esta metodologia, apesar de ainda não poder ser aplicada na clínica, poderá complementar as técnicas antimicrobianas convencionais, por ser uma metodologia simples, de fácil emprego e baixo custo, podendo inclusive ser associada à possibilidade do uso de diferentes agentes fotossensíveis e adequada às necessidades da prática odontológica.Unbalance in the development of the mouth macrobiota can originate some pathologies, dental cavity being among them - a chronic disease - contagious, of multifactorial etiology, but extremely related to the Streptococcus mutans bacteria, which, through its fermentative metabolism, destroys tooth mineralized structures. Besides that, the increase in resistance to antibiotic therapy, due to the existence of biofilm (also formed by S. Mutans) and to non successful bactericide treatments, makes alternative antimicrobial techniques development an important focus in this research area. So, in search of new methodologies against microorganisms studies using the Photodynamic Therapy (TFD) have been employed to achieve inactivation of bacteria such as S. mutans. TFD is a therapeutical modality in which there is an integration of a visible light, a dye and oxygen and, when they interact, there is the production of different reactive oxygen species (ERO?s) which will lead to a sequence of biological events, resulting in a possible cellular death or inactivation, including microorganisms such as S. mutans. The aim of this work was to evaluate the action of TFD on S. mutans bacteria in planktonic medium of forming biofilm. So, the standardized methodology allowed the cultivation of bacteria in liquid media (planktonic) or in the biofilm form, making it possible to do tests with the application of the photodynamic therapy. The analysis of the growth curves allowed the evaluation of the anaerobic metabolism of S. mutans, which consumes fermentable sugars (glucose, fructose, sucrose and maltose), and is apt in acid production. According to what is was proposed, a odontological resin photopolymerizer was used as light source in TFD. This light is sent in variable wave lengths (made possible thanks to the change of the light filter in the equipment) which photoactivate the different dyes used, such as Rose Bengal, Protoporfirine IX (PPIX) and the Zinc Phtalocyanine. These photosensitive agents, after being irradiated, produce reactive oxygen species, specially the singlet oxygen, which leads to the bacterial inactivation observed in the experiments done. Nonetheless, the light concentrations and dyes used in the bacterial inactivation have shown low toxicity values for fibroblasts cultures. Besides that, the high difference between the dye concentrations which causes the death of bacteria in the presence and absence of light indicates that the compounds produced by the photoactivation are the responsible for the bacterial death in planktonic media. As for the biofilm formed by S. mutans, it is possible to have a decrease in its formation with TFD as much as with the use of fluoride. Cells irradiated immediately after the dye addition were similarly inactivated after TFD, so a previous incubation for the homogeneous distribution of the photosensitive agent can be discarded. Apparently, the TFD did not cause changes in the total APTase activity extracted from bacteria membrane. The experiments for the determination of dye location in the cell or for the evaluation of its acidogenic capacity were not conclusive in relation to the possibility of reactive species to be causing damage to the wall, plasmatic membrane or still in some cytoplasmatic biomolecule of the bacteria. In addition, the studies of lipidic peroxidation, DNA analysis and stress proteins after TFD did not bring any conclusive additional information about the specific target of ERO?s that cause bacterial inactivation. This methodology, although can?t be applied in clinic yet, can complement the conventional antimicrobial techniques, being a simple methodology, of easy used and low cost, which can also possibly be associated to the use of different photosensitive agents and adjusted to the needs of odontological practice