The role of the quantity of larval diet in caste determination of the stingless bee Scaptotrigona aff. depilis (Moure, 1942) (Hymenoptera, Apidae, Meliponini) a morphometric, gene expression e hormone titer analysis

Neste estudo, foi investigado o efeito da dieta larval no desenvolvimento de características morfológicas casta-específicas e na expressão de alguns genes durante o desenvolvimento da abelha sem ferrão Scaptotrigona aff. depilis . Nesta espécie, as castas femininas são determinadas pela quantidade de alimento consumida durante o desenvolvimento larval. Grupos experimentais larvas criadas in vitro foram feitos com duas quantidades diferentes de alimento larval, obtido de favos recém provisionados nesta espécie. As larvas do primeiro grupo receberam 32l de alimento larval, correspondente a quantidade média de alimento recebida por larvas de operárias naturalmente, já as larvas do segundo grupo receberam 130l, correspondente a quantidade média encontrada naturalmente em células reais. Todas as larvas criadas com 130l de alimento larval se desenvolveram em rainhas, como esperado; da mesma forma, a maioria das larvas criadas com 32l se desenvolveram em operárias. Interessantemente, porém, algumas larvas deste grupo se desenvolveram em rainhas miniaturas, sugerindo que outros fatores, além do trófico, estejam envolvidos na determinação de castas em S. aff. depilis. Subsequentemente, analisamos os títulos de hormônio juvenil (HJ) na hemolinfa por radioimunoensaio durante quatro estágios do último instar larval e encontramos que as larvas do grupo de 130l de dieta apresentaram maiores títulos no estágio defecante (LD) (p=0,034, t-test), se comparado com as larvas do grupo de 32l. Os níveis de expressão de determinados genes que foram previamente descritos em outras espécies como expressos preferencialmente em rainhas. Um destes genes, dnmt-3, codifica a DNA metiltransferase envolvida na metilação do DNA. Para este gene, encontramos maiores níveis de transcritos nas larvas alimentadas como rainhas (130l) nos estágios LPD e LD (p=0,029, Mann-Whitney), do que as larvas que receberam 32l. Analisamos também dois genes envolvidos no metabolismo do HJ, e para um deles, jheh, codificador de uma epóxido-hidrolase do hormônio juvenil, não encontramos diferença nos níveis de mRNA entre larvas de rainhas e operárias. Para jhe, o qual codifica a esterase do hormônio juvenil, encontramos maiores níveis de transcritos no estágio LD nas larvas criadas com 130l de alimento. Isso indica que a expressão de jhe pode ser induzida pelo aumento dos títulos de HJ neste estágio. Os dois genes, hmgr e mfe, envolvidos no passo inicial e final da síntese do HJ, respectivamente, o primeiro mostrou uma pequena variação nos níveis de expressão, sendo que a expressão de mfe foi menor nas larvas criadas com 32l de alimento larval e foi encontrado um pico de expressão no estágio LPD nas larvas alimentadas com 130l. O produto desse gene, metilfarnesoato epoxidase, está envolvido no passo limitante da síntese de HJ em Apis mellifera. Dois outros genes analisados foram o homólogo ao EcR, codificador do receptor de ecdisona e o usp, codificador do potencial receptor do HJ. Seus níveis de expressões foram maiores nos estágios LPD e LD, respectivamente, nas larvas alimentadas com 130l de alimento e os níveis de EcR se correlacionaram com o perfil dos títulos de ecdisona e os de usp com os títulos de HJ, publicados para esta espécie. Não houve diferença nos níveis de expressão dos genes selecionados que pudessem relacionar ou permitir distinguir as rainhas miniaturas das operárias durante os estágios do desenvolvimento estudados. Uma análise morfométrica de adultos faratos indica claramente que as rainhas miniaturas são rainhas autênticas.In this work we investigated the role played by the larval diet in the development of caste-specific morphological traits and in the expression of candidate genes during the development of the stingless bees, Scaptotrigona aff. depilis. In this species, the female castes are determinate by the amount of food consume during larval development. Experimental groups of larvae were reared in vitro on two different quantities of larval food obtained from newly provisioned brood cells of this species. Larvae of the first group received 32l of larval food, corresponding to the quantity usually received by the workers larva, whereas larvae of the second group received 130l, corresponding to the quantity normally deposited in queen cells. All larvae reared on 130l of larval food developed into queens, as expected, and similarly, most of the larvae reared on 32l developed into workers. Interestingly, however, some larvae of this group developed into miniature queens, suggesting that factors additional to the trophic ones may be involved in caste determination in S. aff. depilis. We subsequently analyzed the hemolymph juvenile hormone (JH) titers by radioimmunoassay during four stages of the last larval instar and we found that larvae of the 130l diet group had higher JH titer in the defecating stange (LD) (p=0,034, t-test) than larvae of the 32l diet group. Next we analyzed the expression levels of set of candidate genes that had previously been described as preferentially expressed in queens of others bee species. One of these genes dnmt-3, encodes DNA methyltransferase involved in DNA methylation. For this gene we found higher transcripts levels in prospective queens during the final larval stage (both in pre-defecating larvae LPD and defecating larvae- LD) (p=0,029, Mann-Whitney). We also analyzed two genes involved in JH metabolism, and for one of them jheh, encoding a juvenile hormone epoxide hydrolase, we did not find any differences in mRNA levels for queens and workers larvae. For jhe, which codes juvenile hormone esterase we found higher transcript levels in the LD stage in larvae reared on 130l of larval food. This indicates that jhe expression may be induced by an elevated JH titer during this stage. For two genes, hmgr and mfe, involved in an initial and a final step of JH synthesis, respectively, the first one showed little variation in expression levels, whereas mfe expression was lower in larvae reared on 32l of larval food and we found an expression peak in the LPD stage (p=0,029, Mann-Whitney) of larvae reared on 130l larval food. The product of this gene, a methylfarnesoate epoxidase, has been shown to be involved in a rate-limiting step of JH sunthesis in the honey bee, Apis mellifera. The other two genes analyzed were the EcR homolog encoding an ecdysone receptor and usp coding for potencial JH receptor. Their expressions were higher during LPD (p=0,006, t-test) stages and LD (p=0,026, t-test), respectively, in larvae fed with 130l of food and the levels of transcripts of EcR correlated with changes in the ecdysone titer and usp with the JH titer published for this species. We did not find differences in expressions levels for any of these candidate genes that could related to and allow to distinguish between prospective miniature queens and workers in these stages. A morphometric analysis of pharate adults, however, clearly demonstrated that the miniature queens are authentic queens