Real Time PCR for the evaluation of parasitemia in patients with chronic Chagas disease and in HIV-Trypanosoma cruzi co-infection with or without reactivation

Introdução: A reativação da doença de Chagas crônica, descrita em aproximadamente 20% dos pacientes co-infectados por HIV/Trypanosoma cruzi (T. cruzi), apresenta-se geralmente como doença grave, com meningoencefalite e miocardite. O diagnóstico baseia-se em métodos diretos, no sangue ou outro material biológico, podendo ser estabelecido em exame histopatológico, sendo associado à elevada parasitemia ou a multiplicação de T. cruzi nos tecidos comprometidos. A letalidade é elevada principalmente nos pacientes que não receberam pelo menos 30 dias de terapêutica. Dessa forma métodos mais sensíveis e mais rápidos são necessários visando a detecção precoce do parasito. A proposta deste estudo é avaliar o papel da PCR em tempo real na determinação do nível de parasitemia em pacientes infectados por HIV com e sem reativação da doença de Chagas. Métodos: Noventa e uma amostras coletadas de pacientes com doença de Chagas 57 com doença de Chagas crônica (CR), 34 com co-infecção HIV-T cruzi, destes, 29 sem reativação (CO) e 5 com reativação da doença de Chagas foram analisadas por provas qualitativas: PCR para seqüência de DNA do cientoplasto (kDNA), hemocultura e xenodiagnóstico, e provas quantitativas: PCR em tempo real (qPCRTR), PCR competitiva (PCR-C), hemocultura considerando % de tubos positivos e xenodiagnóstico com % de ninfas positivas. As variáveis quantitativas moleculares e parasitológicas foram avaliadas pelo coeficiente de correlação de Spearman, bem como as variáveis moleculares, número de T. cruzi/mL e carga viral HIV, número de T. cruzi/mL e nível de células CD4 +/mm3, CD8 +/mm3 e razão CD4 +/CD8 +. Resultados: Foram observadas diferenças significantes entre pacientes co-infectados com e sem reativação. A maior parasitemia, detectada por qRT-PCR, foi em pacientes com reativação da doença de Chagas crônica (média 102235,3; mediana 51333,3 e número de T. cruzi/mL de sangue entre 939 e 352000), seguido pelos pacientes com co-infecção (média 255; mediana 54,3 e parasitemia entre 0 e 2405 T. cruzi/mL de sangue) e finalmente pelo grupo de pacientes com doença crônica (média 14,3; mediana 1; e parasitemia entre 0 e 146 T. cruzi/mL de sangue). O coeficiente de correlação de Spearman mostrou correlação entre xenodiagnostico x hemocultura, e entre xenodiagnostico x PCR competitiva ou PCR em tempo real. Houve maior correlação entre PCR competitiva x PCR em tempo real, e número de parasitos e as variáveis: carga viral do HIV, número de células T CD4 + ou razão CD4 +/CD8 +. Conclusões: RT-PCR foi capaz de distinguir entre pacientes co-infectados HIV/T. cruzi com e sem reativação sendo proposta sua utilização como marcador para terapia preemptiva na reativação da doença de Chagas em pacientes com HIV/T. cruzi. Adicionalmente, o nível de parasitemia foi correlacionado positivamente com carga viral e negativamente com nível de células T CD4+/mm3 de sangue e razão CD4+/CD8+Background. The reactivation of chronic Chagas disease, described in approximately 20% of HIV/Trypanosoma cruzi infected patients, is commonly expressed by severe and lethal meningoencephalitis and myocarditis. The gold standard for the reactivation diagnosis is based on direct methods, the parasite is observed by direct microscopic examination of fresh buffy coat or through the Quantitative Buffy Coat, wich can be applied to samples of cerebrospinal fluid or blood. The diagnosis of reactivation can be achieved by histological study, showing large numbers of parasites in tissue and acute inflamatory infiltrate. However diagnosis of reactivation is often difficult, it has been established in patients with high parasitemia, usually with severe clinical symptoms, this patients death before or during therapy. The purpose of this study was to evaluate the role of real time PCR for evaluation of the level of parasitemia on patients with HIV and T.cruzi infection with and without reactivation of Chagas disease. Methods. Ninety-one samples from patients with Chagas disease, 57 with chronic Chagas\' disease (CR), 34 with infection HIV/T. cruzi, 29 without reactivation (CO) and 5 with reactivation of Chagas\' disease, were analyzed by qualitative methods: Polymerase chain reaction with kDNA S35/S36 sequence, xenodiagnosis and blood culture, and quantitative methods: Real-time PCR, competitive PCR, blood culture considering % of positive tubes, xenodiagnosis with % of positive nymphs. Results: There were significant differences between groups, the highest parasitemia was observed in patients with reactivation of chronic Chagas\' disease (mean 102,235.3; median 51,333.3 and number of T. cruzi/ml of blood between 939 and 352,000), followed by patients with co-infection (mean 255, median 54.3 and parasitemia 0 to 2405 T. cruzi/mL of blood) and finally by the group of patients with chronic disease (mean 14.3, median 1 and parasitemia 0 to 146 T. cruzi/ml of blood). Spearman correlation coefficient showed correlation between xenodiagnosis x blood culture and between xenodiagnosis x competitive PCR or real time PCR. Stronger Spearman correlation index was found between cPCR x RTPCR, number of parasites and the variables: HIV viral load or CD4 + number or CD4 +/CD8 + ratio Conclusions. RT-PCR is able to distinguish between HIV/T. cruzi infected patients with or without reactivation and is proposed as a marker for preemptive therapy in Chagas disease reactivation. Additionally, the level of parasitemia was correlated positively with viral HIV load and negatively with CD4+/mm3 of the blood and CD4+/CD8+ rati