Contribution to the study of dioxetanes and their role in photobiochemistry in the dark

Do interesse em espécies eletronicamente excitadas geradas por sistemas luminescentes químicos e biológicos, nasceu o interesse dos químicos pelos dioxetanos, seu comportamento e suas propriedades. Propostos como intermediários de tais reações, estes compostos (peróxidos cíclicos de anel tetratômico) sofrem clivagem térmica unimolecular com produção de dois fragmentos carbonílicos, um deles no estado eletronicamente excitado. Em geral, dioxetanos substituídos por grupos alquílicos e arílicos levam a altos rendimentos de estados triplete. Propôs-se, então, reinvestigar a termólise do tetrametildioxetano (TMD) em meio aquoso e utilizar esta fonte de acetona triplete como modelo químico, para o sistema enzimático de produção de acetona triplete (oxidação aeróbica do isobutanal (IBAL)/peroxidase (HRP)), em estudos de supressão e transferência de energia. O TMD tem sido preparado e cristalizado rotineiramente em nosso laboratório, pelo método de Kopecky. Os parâmetros de ativação de termólise (estabilidade térmica e rendimentos de quimiexcitação dos produtos) foram reestudados em solventes aromáticos (benzeno e tolueno), cicloalifáticos (ciclohexano e decalina), próticos (água) e apróticos (acetonitrila e CCl4).Concluiu-se que: (i) a estabilidade do TMD não é afetada pela natureza do solvente (Ea ~ 27,0 kcal mol-1); (ii) a eficiência global de transferência de energia triplete (acetona) → singlete (9,10-dibromoantraceno) nos solventes não aromáticos é praticamente constante (ΦTS ~ 10 %); (iii) em solventes aromáticos onde o doador excitado é na verdade um \"exciplex\" acetona-solvente, ΦTS ~ 30 %. A relação entre os rendimentos de quimiexcitação de triplete e singlete (3Φ /1Φ) em água foi determinada como sendo da ordem de 1x103, que concorda com valores determinados em tolueno e benzeno (7x102 e 8x102, respectivamente). Nos estudos em meio aquoso, o DBAS e o DPAS foram utilizados para monitorar a presença de acetona triplete e singlete, formada química, fotofísica ou enzimaticamente. Ambos foram sintetizados em nosso laboratório e suas propriedades fotofísicas, determinadas em água deionizada a 20°C. Através da medida de fluorescência do DBAS excitado por transferência de energia a partir de acetona triplete, determinou-se a vida média de acetona triplete em meio aquoso aerado e deaerado (τaer ~ 2 µs e τN2 ~ 10 a 20 µs). Seis classes de interceptadores de acetona triplete, gerada na termólise de TMD, foram investigadas em tampão aquoso a 35°C: dienos (ácido sórbico e acrilonitrila), pigmentos xantênicos, riboflavina, tirosina e derivados 3,5-dihalogenados, indol e derivados indólicos, e uma série de quinonas. Em geral, os valores das constantes de supressão de acetona triplete produzida diretamente no seio da solução, a partir de TMD, estão pelo menos uma ordem de grandeza abaixo dos valores correspondentes para acetona triplete produzida enzimaticamente. Estes resultados são consistentes com a hipótese de que acetona triplete gerada dentro da enzima tem vida média mais longa, pois se encontraria parcialmente \"protegida\" da ação supressora de O2. Outros argumentos podem, entretanto, ser igualmente satisfatórios. Parece claro que os supressares indólicos (IP ~ 8 eV) e ácido sórbico exercem sua ação através da formação de complexos de transferência de carga, tirosina e corantes xantênicos (IP ~ 7 eV) por um mecanismo de transferência de elétrons e riboflavina por mecanismo tipo Förster. As quinonas, cuja afinidade eletrônica é bastante alta (IP ~ 10-11 eV), suprimem acetona triplete por um mecanismo controlado por difusão; com estes compostos, o limite superior do esperado para um processo puramente colisional seria atingido (kq ~ 1 a 2x1010 M-1s- 1, em água a 35°C). De fato, derivados metilados de p-benzoquinona e naftoquinona suprimem acetona triplete com velocidade mais baixa, enquanto que em solvente mais viscoso (decalina, em relação a n-hexano), kq também é mais lenta. Por outro lado, observou-se um marcante \"efeito de átomo pesado\" na eficiência de transferência de energia triplete (acetona) → singlete (corante xantênico): ΦTS para fluoresceína, eosina e Rose Bengala na proporção 1:15:320. A oxidação da clorpromazina (CPZ) por reação com o TMD foi estudada em meio aquoso e meio tamponado e verificou-se que esta independe da formação de espécies excitadas, apesar da CPZ apresentar-se como eficiente supressor de acetona triplete. Espectros de RMN1H mostraram que a reaçao entre CPZ e TMD gera a clorpromazina-5-óxido (sulfóxido; CPZO) e o óxido de tetrametiletileno (o epóxido correspondente ao TMD). Estudos de espectroscopia U.V. e de cromatografia gasosa indicam que a estequiometria da reação TMD/CPZ é 1:1 e que a presença de competidores de supressão de acetona triplete não altera a velocidade da reação nem a estequiometria da mesma. Em vista destes resultados, reestudou-se a oxidação de CPZ pelo sistema do IBAL/HRP/O2, estudo feito inicialmente por DURÁN e colaboradores, no qual os autores propõem que a oxidação de CPZ é resultante de transferência de energia de excitação da acetona triplete gerada enzimaticarnente. Usando métodos inexplorados até então, verificamos a possibilidade de esta oxidação ocorrer por reação direta entre CPZ e os radicais de HRP formados durante a oxidação do isobutanal, sem a intervenção da acetona triplete. Outro estudo parelelo a este, foi feito visando determinar parâmetros cinéticos e termodinâmicos em dioxetanos com diferentes tipos de hidrogênios em posição γ do anel. Este estudo visava determinar de que maneira a interação oxigênio do anel-hidrogênio gama influia em tais parâmetros. Sintetizou-se uma série de 3-metil-3-alquildioxetanos (alquil = n-propil, n-butil e neopentil) e determinamos os seus parâmetros de ativação de termólise (Ea, ΔS≠, 3Φ e 1Φ). Constatamos que não há diferença significativa entre estes dioxetanos, sendo assim, a interação hidrogênio gama-oxigênio do anel é inexpressiva. Porém, quando comparados com outros dioxetanos da mesma série, onde alquil = etil, isopropil e terc-butil (estudo em conjunto com outros pesquisadores) nota-se urna expressiva mudança na Ea a medida que aumenta o número de grupos rnetila na posição α, indicando um efeito estérico do tipo 3,3.The interest in eletronically excited species generated by chemical and biological systems give rise to at interest in dioxetanes, their behavior and their properties. These coumpounds (cyclic four-membered ring), which have been proposed as intermediates in such reactions, undergo unimolecular thermal cleavage yielding two carbonyl fragments, one of which is tipically formed electronically excited. In general, alkyl and aryl substitued dioxetanes give high yields of triplet states. In the present work, the thermolyses of tetramethyldioxetane (TMD) was reinvestigated in agueous medium. This source of triplet acetone was then employed in quenching and energy transfer studies as a chemical model for the enzymatic systems which produces triplet acetone I aerobic oxidations of isobutanal (IBAL) catalysed by horseradish peroxidase (HRP) I. TMD was prepared and crystalised normally in our laboratory using Kopecky\'s method. Thermal activation parameters (thermal stability and chemiexcitation quantum yields) have been determined in several types of solvents, including aromatics (benzene and toluene), cycloaliphatics (cyclohexene and decalin), protic (water) and aprotic (acetonitrile and carbon tetrachloride) .We conclude that: (i) TMD stability is not affected by the nature of the solvente (Ea ~ 27,0 kcal/mol), (ii) the overall energy transfer efficiency 3Ac* → 1DBAS* is practically constant (ΦTS ~ 10%) in non-aromatic solventsi (iii) in aromatic solvents, where the excited donor is an acetone-solvent \"exciplex\", ΦTS ~ 30%. The ratio of triplet and singlet chemiexcitation yields (3Φ /1Φ) in water was deterrnined to be 1x103. This value is in good agreement with these determined in toluene and benzene (7x102 and 8x102, respectivelly). In studies in aqueous medium, DBAS and DPAS were used as probes to monitor the production of triplet and singlet acetone formed chemically, photophysically or enzymatically. Both probes were prepared in our laboratory and their photophysical properties deterrnined in deionized water at 20°C. The lifetime of triplet acetone in aerated and deaerated aqueous media was deterrnined on the basis of the cherniluminescence intensity of DBAS excited by energy transfer (τaer ~ 2 µs e τN2 ~ 10 a 20 µs). Six classes of quenchers were investigated in aqueous buffer at 35°C: dienes (sorbic acid and acrylonitrile), xanthene dyes, tyrosine and its 3,5-dihalogenoderivatives, indole and indolic derivatives, riboflavin and a serie of quinones. In general, rate constants for quenching of triplet acetone produced free in solution via TMD thermolyses are one order of magnitude lower than those for quenching of enzymatically generated triplet acetone. These results are in line with the hypothesis of a longer lifetime of the triplet acetone generated within the enzyme due a parcial \"protection\" for O2 quenching. It seerns clear that the indolic coumpounds (IP ~ 8 eV) and sorbic acid quench triplet acetone through the forrnation of a charge-transfer complex, tyrosine ans xanthene dyes (IP ~ 7 eV) by an electron-transfer mechanism and riboflavin by a Förster type mechanism. The quinones, which have high electronic affinities (IP ~ 10- 11 eV) , quench triplet acetone by a diffusion controlled process (kq ˜ 1 to 2x1010 M-1s-1 in water at 35°C). Methyl derivatives of p-benzoquinone and naphtoquinone quench triplet acetone at a slower rate; kq is also lower in a more viscous solvent (decalin versus n-hexane). On the other hand, the results indicate a strong \"heavy atom effect\" on the energy transfer efficiency from triplet acetone to singlet xanthene dye: ΦTS for fluorescein, eosin and Rose Bengal in the ratio 1:15:320. The chlorpromazine (CPZ) oxidation by reaction with TMD was studied in aqueous and buffered media. This reaction does not depend on the production of excited species, even though CPZ proved to be an efficient trip1et acetone quencher. The NMR1H spectra showed that chlorpromazine-5-oxide and tetrarnethylene oxide are the products of the reaction between CPZ and TMD. UV spectroscopic and gas chromatographic studies indicated a 1:1 stoichiometry for the TMD/CPZ reaction and no competition between this reaction and triplet acetone quenching by indole or sorbate. In view of these results, we reinvestigated the oxidation of CPZ by the IBAL/HRP/02 system, a reaction which has been suggested to occur via energy transfer from triplet acetone to CPZ in an earlier study. Using methods developed since the earlier study, we verified that this reaction in fact occurs via direct reaction between CPZ and HRP radicals produced during IBAL oxidation, without the intervention of triplet acetone. In another parallel study, we determined kinetic and thermodinamic parameters of a series of dioxetanes with different types of γ hydrogens in order to examine how the interaction between oxygen and the γ hydrogens might influence these parameters. Thus, a series of 3-methyl-3-alkyldioxetanes (alkyl = n-propyl, n-butyl and neopentyl) was sintesized and their thermal activation parameters (Ea, ΔS≠, 3Φ and 1Φ) determined. The results indicated that there are no significant differences among these dioxetanes; consequently the oxygen-γ hydrogen interaction is relativelly unimportant. However, when compared with other dioxetanes of similar structure (alkyl=ethyl, isopropyl and terc-butyl; joint study done with other researchers), there is a significant change in Ea upon increasing the number of rnethyl groups at the α position, pointing to a steric effect of the 3,3 type