Cloning, expression, purification and characterization of human papillomavirus (HPV) capsid proteins

O Câncer Cervical é um importante problema de saúde pública, causando aproximadamente 270 milhões de mortes anuais. Atualmente, esse câncer é o segundo mais comum em mulheres no mundo, com os maiores índices de incidência ocorrendo nos países em desenvolvimento. O Câncer cervical tem como agente etiológico o Papilomavírus Humano (HPV). O vírus possui DNA circular duplo com genes que codificam oito proteínas, E1, E2, E4, E5, E6, E7 (não estruturais), e L1 e L2 (estruturais) que formam o capsídio viral. A proteína L1 quando produzida em sistema heterólgo de expressão tem a capacidade de auto-arranjo em partículas semelhantes ao vírus chamadas de VLPs (\"Vírus like Particles\"), que são a base das vacinas profiláticas disponíveis, Gardasil® e Cervarix®. Neste trabalho, foram produzidas VLPs da proteína L1 do HPV-16 na levedura metilotrófica Pichia pastoris utilizando dois tipos de vetores de expressão para leveduras, um epissomal e outro integrativo, para os trabalhos de purificação. Inicialmente as amostras obtidas ao final da purificação apresentaram degradação e agregação da proteína L1, além de contaminantes. O protocolo de purificação foi modificado e as amostras obtidas no final do processo de purificação não apresentaram degradação e nem agregação da proteína L1, embora ainda tenha sido detectada a presença de contaminantes e, portanto, as amostras obtidas estavam semi-purificadas. Uma segunda abordagem para o desenvolvimento de uma vacina alternativa foi realizada, na qual foram produzidos candidatos vacinais baseados na proteína L2 do Papilomavírus Humano (L2 do HPV-16, L2 do HPV-18 e L2 Multimérica), e também foram expressas proteínas fusionadas ao domínio ZZ de Staphylococcus aureus, utilizado neste caso como adjuvante. Em geral as proteínas de fusão, ainda que apresentando a fusão em sua forma funcional, geraram uma fraca indução de anticorpos IgG e de anticorpos neutralizantes. Pode-se observar uma produção de anticorpos neutralizantes contra pseudovírus homólogos e heterólogos que dependeu da combinação com os adjuvantes utilizados. Numa tentativa de maximizar a eficiência imunológica dos antígenos utilizados, um novo ensaio de imunização foi realizado com uma formulação conjunta contendo três proteínas (L2 do HPV-16, L2 do HPV-18 e L2 Multimérica), sendo também avaliadas as propriedades de três adjuvantes. A combinação da formulação vacinal com os adjuvantes gerou altos níveis de anticorpos L2-específicos, destacando-se as formulações com o hidróxido de alumínio/MPLA e com a vacina celular Pertussis low. Com a utilização desses adjuvantes, os níveis de anticorpos permaneceram elevados a longo termo. Pode-se observar a imunogenicidade de cada um dos antígenos dependeu de sua formulação com os adjuvantes testados.Cervical cancer is one of the most important problems of public health, causing nearly 270 million deaths annually. Currently, cervical cancer is the second more common type in women worldwide and the highest incidences occuring in developing countries. Human papillomavirus (HPV) are the ethiologic agents of cervical cancer. HPV have a double-stranded circular DNA genome encoding eight viral proteins, E1, E2, E4, E5, E6, E7 (non-structural), and L1, L2 (structural), the last ones forming the viral capsid. L1 protein expressed in heterologous systems self-assembles into VLPs (\"Virus like Particles\"), the base of prophylactic vaccines available commercially, Gardasil and Cervarix. In this work, we produced VLPs of HPV-16 L1 protein in the methylotrophic yeast Pichia pastoris for purification assays. Initially, samples obtained from purification presented degradation and aggregation of L1 protein and also contaminants. The purification protocol was modified and samples obtained in the new process did not present degradation nor aggregation but the presence of some contaminants could still be detected. Therefore, samples obtained were semi-purified. A second approach to the development of an alternative vaccine was performed with the production of vaccine candidates based on the HPV L2 protein (HPV-16 L2, HPV-18 L2 and Multimeric L2) and we also expressed the same proteins fused to Staphyloccocus aureus ZZ domain, using it as an adjuvant. In general, the fused proteins induced low antibodies titer and low neutralizing antibodies titer when compared to other formulations. Neutralizing antibodies elicited against homologous and heterologous pseudovirus depended on the adjuvant used. In another approach, trying to enhance immunologic antigen efficiencies, an immunization assay was performed with a formulation containing L2 HPV- 16, L2 HPV-18 and Multimeric L2 and the properties of three adjuvants were assessed. The vaccine formulations adjuvanted with alum/MPLA and cellular Pertussis low vaccine induced the highest levels of L2-specific antibodies. In addition, the usage of adjuvants maintained the antibody levels in the long term. The immunogenicity of each antigen depends on the adjuvant combination used