Identification of molecular markers for thyroid cancer by cDNA microarrays

Doenças tireoideanas são bastante comuns, sendo sua maioria benigna. A relação entre os diversos tipos de doenças tireoideanas, bem como seus aspectos moleculares, são pouco conhecidos. O bócio (hiperplasia), por exemplo, é descrito por alguns como relacionado com carcinoma (tumor maligno) papilífero, enquanto que outros afirmam não haver relação causal entre as duas doenças. A questão mais desafiante, porém, refere-se à distinção entre adenoma (tumor benigno) e carcinoma folicular, que atualmente é feita apenas após à cirurgia, não permitindo tratamento diferenciado para os dois tipos de tumor. Este trabalho buscou identificar genes diferencialmente expressos entre tecido tireoideano normal, bócio, adenoma e carcinoma papilífero utilizando microarrays. Carcinomas foliculares não foram incluídos devido ao número e tamanho reduzidos das amostras. Dois tipos de array foram utilizados: arrays em membranas de nylon, contendo 213 clones obtidos por DDRT-PCR de amostras de tireóide, e arrays em vidro, contendo 3800 clones ORESTES. Experimentos utilizando o primeiro tipo de array identificaram três genes diferencialmente expressos, cuja expressão foi analisada por RT-PCR em 10 amostras de cada tipo de tecido. Dois deles foram capazes de diferenciar carcinomas papilíferos de tecido normal e bócio com 89% de precisão para o tumor maligno e 80% para os tecidos não malignos. Os arrays em vidro foram utilizados para avaliar o perfil de expressão de aproximadamente 10 amostras de cada tipo de tecido tireoideano. Foram identificados 160 clones diferencialmente expressos entre quaisquer dois tipos de tecido, cujas seqüências foram determinadas e comparadas com as dos bancos de dados. Dentre os genes mais interessantes destacam-se o correspondente à ATPase Na/K, cuja expressão está reduzida nos carcinomas em relação a tecidos normais e adenomas, o da proteína PDCD4, envolvida em morte celular programada, mais expresso em adenomas e tecidos normais em comparação com carcinomas e bócios, e os da calgizzarin (S100A11) e da α1-anti-tripsina, ambos mais ativos nos carcinomas do que nos demais tecidos. Todos esses genes já foram descritos como diferencialmente expressos em algum tipo de tumor. Este trabalho levou à padronização da metodologia de microarray em lâminas de vidro em nosso laboratório, bem como à identificação de genes que podem elucidar as alterações envolvidas na formação do bócio, adenoma e carcinoma papilífero. A implantação da técnica de amplificação de mRNA em nosso laboratório viabilizou a utilização de 10 amostras de carcinoma folicular, cuja massa de RNA total era insuficiente para as hibridizações. Essas amostras serão hibridizadas, juntamente com 10 amostras de adenoma, com microarrays contendo 4800 genes humanos conhecidos para a busca de genes diferencialmente expressos, de grande interesse diagnóstico.Thyroid diseases are very common and are usually benign. The causal relationships among the different types of disease, as well as their molecular aspects, are not well understood. The goiter (hyperplasia), for instance, is described by some as related to papillary carcinoma (a malignant tumor), while others say there is no causal relationship between the two diseases. The most defying question, however, concerns the distinction between adenoma (benign tumor) and follicular carcinoma, which is currently made only after surgery, not allowing distinct treatments for the two kinds of tumor. This work aimed to identify differentially expressed genes among normal thyroid tissue, goiter, adenoma and papillary carcinoma using microarrays. Follicular carcinomas were not included due to the reduced number and size of the samples. Two kinds of array were used: arrays in nylon membranes, with 213 clones isolated from thyroid samples by differential display (DDRT-PCR); and glass slide arrays containing 3800 ORESTES clones.Experiments using the first type of array identified three differentially expressed genes, whose expression was analyzed by RT-PCR in 10 samples of each kind of tissue. Two of these genes were able to differentiate papillary carcinomas from goiters and normal tissues with precisions of 89% for the malignant tumor and 80% for the non-malignant tissues. Glass slide arrays were used to evaluate gene expression profile of approximately 10 samples of each type of thyroid tissue. 160 clones differentially expressed between any two tissues were identified, and their sequences were determined and compared with databases. Among the most interesting genes are Na/K ATPase gene, whose expression is reduced in carcinomas compared to normal tissues and adenomas, the gene corresponding to PDCD4 protein, involved in program cell death, with elevated expression in adenomas and normal tissues than carcinomas and goiters, and the genes of calgizzarin (S100A11) and α1-antitrypsin, both more active in carcinomas than the other tissues. All these genes have already been described as differentially expressed in at least one type of human cancer. This work led to the standardization of glass slide microarray technology in our laboratory, and to the identification of genes that may clarify the alterations involved in the formation of goiter, adenoma and follicular carcinoma. The implementation of mRNA amplification technique in our laboratory allowed the utilization of 10 samples of follicular carcinoma, whose mass was insufficient for microarray hybridizations. These samples will be hybridized along with 10 samples of adenomas, with microarrays containing 4800 known human genes to search for differentially expressed genes, of great diagnostic interest