Study of electrocomunication in gymnotus carapo and gnathonemus petersii for long time using realistic stimulation protocols

A bioeletrogenese tem atraído a atenção da ciência desde a antiguidade. Capazes de produzir campos elétricos e também de sentir estes campos, os peixes elétricos pulsadores de campo fraco são um modelo de estudo praticamente com características únicas em neuroetologia, ja que permitem ao experimentador medir de maneira não invasiva os sinais espaco-temporais envolvidos em pelo menos duas capacidades complexas do sistema nervoso do animal: a eletrolocalizacao (em que e produzida uma imagem elétrica das proximidades) e a eletrocomunicacao (em que os padrões de pulsos são usados para identificar conspecificos, seu sexo, tamanho, resolver disputas de território, etc). Entretanto, como os pulsos geralmente são idênticos em indivíduos de uma mesma espécie e a amplitude do sinal medido depende da distancia dos animais aos eletrodos usados, experimentos com animais livres para se movimentar são muito difíceis de realizar, mais ainda experimentos com mais de um animal interagindo. Por isso, na maioria dos trabalhos encontrados na literatura o comportamento elétrico dos animais e registrado durante curtos intervalos de tempo em que seus movimentos eram bastante restritos ou limitados a agua bem rasa. Além disso, os estímulos eram geralmente compostos por pulsos quadrados ou períodos senoidais apresentados a intervalos regulares. Os protocolos experimentais usados eram sempre unidirecionais, ou seja, não dependiam nem se adaptavam a atividade dos peixes. Para lidar com estas limitações, que acreditamos tornarem o comportamento dos animais muito diferente do que ocorre na natureza, desenvolvemos aparatos experimentais para registrar e estudar o comportamento elétrico e motor de peixes elétricos pulsadores nadando livremente por longos períodos de tempo e que podem ser facilmente adaptados para o estudo de diversas espécies. Utilizamos técnicas de interação em tempo real entre computadores e sistema nervoso vivo, adaptado de protocolos do tipo dynamic clamp, para produzir estímulos elétricos realistas e também estímulos luminosos. Mostramos protocolos de estimulação clássicos unidirecionais bem como bidirecionais, dependentes da atividade dos animais. Aplicamos técnicas de analise de dados baseadas na teoria da informação que permitiram associar a entropia da serie de pulsos do órgão elétrico a movimentação do animal. Aplicamos estes aparatos e técnicas para estudar peixes elétricos de campo fraco de espécies que pertencem a ordens diferentes e, portanto, são o resultado de historias evolutivas distintas: o peixe sul americano G. carapo, da ordem dos Gymnotiformes e o peixe africano G. petersii, da ordem dos Mormyriformes. Obtivemos evidencias de comunicação dos animais e estudamos quais os padrões mais prováveis de disparo em diferentes condições. Uma das espécies apresentou um longo transiente quando exposta a um novo ambiente, evidenciando que as técnicas tradicionais de restringir periodicamente o movimento do peixe não são adequadas para o estudo do comportamento desta espécie. Nossos resultados apresentaram varias evidencias de que os animais são capazes de distinguir estímulos realistas (gravados de conspecificos), de estímulos aleatórios com propriedades estatísticas semelhantes e que há 2 valores de echo response validando a necessidade dos métodos de estimulo desenvolvidos. Também pudemos mostrar que protocolos de estimulação em tempo real bidirecionais, são mais efetivos em interagir com o código do peixe quando comparados com os protocolos unidirecionais tradicionais e que os animais são capazes de aprender a controlar seu comportamento motor e também sua frequência de disparo para evitar estímulos indesejados.Bioloelectrogenesis is known since ancient times. Weakly electric fish are a wonderful model in Neuroethology because they produce and sense eletric fields. These unique features allow non invasive experiments to access complex spatio-temporal signals involved in 2 tasks called electrocommunication and electrolocation. Electrolocation is the ability to see the surrounding areas /objects by analyzing changes in the fish\'s own electric field and electrocommunication is the ability to identify conspecifics, fight for dominance etc. In this last task fish have their electric field distorted by conspecifics\' eletric organ discharges. Usually, within species, pulse-type weakly electric fish discharge pulses with similar waveform and the amplitude of the pulse depends on the distance to the recording electrodes being very difficult to measure the discharges in freely swimming animals, specially when 2 or more animals are interacting. For these reasons, most studies found in the literature are done with restrained animals or in shallow tanks. The most commom stimuli used are square/sine waves or very short pre-recorded discharges in classic protocol where the stimuli do not depend on the fish\'s activity. To overcome these issues trying to perform more naturalistic experiments, we developed experimental setups to record the electric and motor behavior in freely pulse-type electric fish for long periods. Our setups have also the advantage of being easy to adapt making possible to study several species. We performed real time experiments with realistic electric and light stimuli using dynamic clamp techniques adapted to Neuroethology. We show both classic unidirectional protocols as well as bidirectional closed loop interaction, taking into account the fish\'s dynamic activity. Analyzes based on Information Theory revealed that the entropy of the electric organ discharges are correlated to the their movement. We performed experiments using the setups and techniques mentioned before in 2 species that have evolved independently: G. Carapo (Gymnotidae) from South America and G. petersii (Mormyridae) from Africa. We show evidence of real communication and we study the inter pulse discharge probability in different behavioral circumstances. One specie showed a long transient behavior when introduced in new environment, hence, the traditional experiments with restrained animals might not be suitable to study natural behavior. Our results show several evidences that the fish can distinguish between realist stimuli from conspecifics and random ones, that there are 2 values of echo response instead of 1, demonstrating the importance of our new setup and protocols. We could also show that closed loop protocols were more effective to stimulate and interact with the fish\'s activity and that the animals are able to control their motor and electric behavior avoiding possibly harmful stimulation