pH-influence on the functional activity of endogenous enzymes (metaloproteinases -2 and -9) that degrade collagen matrix of coronal and radicular human dentin

As metaloproteinases da matriz (MMPs) são uma família de endopeptidades cálcio e zinco dependentes que participam da degradação de praticamente todos os componentes da matriz extracelular. Com o pressuposto de que estas enzimas podem estar relacionadas à progressão da erosão dental e que os agentes ácidos causadores da erosão podem influenciar na ativação das MMPs, o objetivo desse estudo in vitro foi avaliar a influência do pH sobre a atividade funcional das MMP-2 e -9 presentes na dentina coronária e radicular humana. O pó das dentinas coronária e radicular, provenientes de terceiros molares inclusos recém extraídos foi obtido separadamente e submetido ao protocolo de extração das proteínas, com ácido fosfórico a 1%. Após, o extrato contendo as proteínas e o pó de dentina parcialmente desmineralizado foram incubados em uma das respectivas soluções: solução 2 mM de APMA (acetato de 4-aminofenilmercúrio / grupo controle) ou em uma das soluções tampão (fosfato de potássio 0.1 M) com diferentes pHs (2.5, 4.5, 5.0, 6.0 e 7.0). Após a incubação, as proteínas foram separadas por eletroforese, em um gel de poliacrilamida copolimerizado com gelatina, para a avaliação da atividade gelatinolítica das MMPs, por zimografia. Esta análise foi realizada em triplicada e os zimogramas obtidos ao final foram avaliados por densitometria. A quantificação das bandas observadas nos zimogramas foi realizada pelo programa de imagens ImageJ e os dados avaliados de maneira descritiva e qualitativa. Para a avaliação do conteúdo de colágeno solubilizado, o pó de dentina parcialmente desmineralizado e incubado nos respectivos pHs (n = 8) foi mantido em um tampão de incubação durante 24h, e o conteúdo de hidroxiprolina (HYP) liberado neste meio foi mensurado em espectrofotômetro. Os dados obtidos foram avaliados estatisticamente por ANOVA 1 fator, seguido do teste de Tukey, com 5% de significância. A análise por zimografia mostrou bandas evidentes correspondente a MMP-2 na sua forma ativa (66kDa) e bandas menos expressivas relacionadas a sua forma latente (72kDa), tanto para a dentina coronária quanto para a radicular, em todos os grupos experimentais. Não foram identificadas bandas correspondentes a MMP-9, para nenhum dos substratos avaliados. As soluções com os menores pHs (2.5, 4.5 e 5.0) resultaram na maior atividade funcional da MMP-2, em comparação as soluções com os maiores pHs (6.0 e 7.0), em ambos os substratos. Para a análise de HYP, os grupos pH 2.5 e pH 4.5 mostraram valores de absorbância abaixo do limite de detecção do aparelho. Para os demais grupos experimentais, tanto para a dentina coronária quanto para a radicular, foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre eles (p < 0,05). O conteúdo de HYP liberada foi maior para o pH 7.0, comparado aos demais grupos (p < 0,05), exceto para o pH 6.0. Não foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os grupos pH 6.0, pH 5.0 e controle (p > 0,05). Conclui-se que a atividade funcional da MMP-2 é dependente do pH. Os menores pHs promoveram um aumento na ativação da MMP-2 da dentina coronária e radicular humana. Nota-se em pHs próximos ao neutro, uma maior degradação da matriz orgânica dentinária desmineralizada por essas enzimas endógenas.Matrix metalloproteinases (MMPs) are a family of endopeptidades calcium and zinc dependent that participate in the degradation of pratically all components of the extracellular matrix. With the assumption that these enzymes may be related to the progression of dental erosion and acidic agents that cause erosion can influence the activation of MMPs, the aim of this in vitro study was to evaluate the pH-influence on the functional activity of MMP-2 and -9 present in human coronal and root dentin. The powder of root and coronal dentine, from freshly extracted third molars was separately obtained and subjected to protein extraction protocol, with 1% phosphoric acid. After, the extract containing proteins and the partially demineralized powder were incubated in one of the following solutions: 2 mM APMA (4-aminophenylmercuric acetate / control) or one of the buffer solutions (0.1 M potassium phosphate) with different pHs (2.5, 4.5, 5.0, 6.0 and 7.0). After incubation, the proteins were separated by electrophoresis in a polyacrylamide gel copolymerized with gelatin, to evaluate the gelatinolytic activity of MMPs by means of zymography. This analysis was performed in triplicate and the zymograms obtained were evaluated by densitometry. Quantification of the bands observed in zymograms was performed by ImageJ software and the data were evaluated descriptively and qualitatively. To assess the solubilized dentin collagen, the partially demineralized dentin powder treated with different pHs (n=8) was incubated in an artificial saliva for 24 h, and the amount of hydroxyproline (HYP) released in media was measured by spectrophotometer. Data were statistically analyzed by ANOVA one factor, followed by the Tukey\'s test, with 5% significance. Zymography showed evident bands corresponding to active MMP-2 (66kDa) and less expressed bands related to its latent form (72kDa), for both coronal and root dentin, in all experimental groups. No bands corresponding to MMP-9 were identified, for both substrates. The lowest pH solutions (2.5, 4.5 and 5.0) yielded the higher functional activity than did the highest pH solutions (6.0 and 7.0), for both substrates. For HYP analysis, the groups pH 2.5 and pH 4.5 showed absorbance values below the detection limit of the equipment. For the other groups, for both coronal and root dentin, statistically significant diferences were found between them (p<0.05). The amount of HYP was higher for pH 7.0 than all other groups (p<0.05), except for pH 6.0. No statistical difference was found between pH 6.0, pH 5.0 and control (p>0.05). It can be concluded that the functional activity of MMP-2 is pH-dependent. Low pH solutions are able to increase the activation of human coronal and root MMP-2. It is noted in pHs close to neutral, a higher degradation of demineralized dentin organic matrix by these endogenous enzymes