Lymphocytes of Patients with Alzheimer\'s Disease display different DNA Damage Repair Kinetics and Expression Profiles of Stress Response Genes.

A Doença de Alzheimer (DA) é uma demência senil neurodegenerativa crônica, que causa um grande impacto na saúde pública. Apesar de o estresse oxidativo ter sido largamente associado ao processo de envelhecimento e à patogênese das doenças neurodegenerativas (incluindo DA), a literatura sobre o papel do estresse oxidativo no desenvolvimento da DA ainda é escassa assim como para seus fatores de risco. O presente trabalho teve o objetivo avaliar se os linfócitos de pacientes com DA apresentam alterações nos níveis de expressão de alguns genes associados à respostas ao estresse, tais como SOD1, TP53, ATM, ATR, FEN1, FANCG, CDKN1A e MTH1; além de ADAM10 e ADAM17, associados diretamente a patologia. Além disso, foi proposto também avaliar os níveis de danos no DNA e a cinética de reparo dos linfócitos desses indivíduos quando tratados com peróxido de hidrogênio (H2O2), um agente indutor de danos no DNA. As amostras de sangue foram coletadas de pacientes com DA (idade entre 65 a 80 anos) e indivíduos idosos de mesma idade para analisar a expressão gênica protéica por Western blot (n=6) e a expressão transcricional por PCR quantitativa em tempo real (n=7). O ensaio cometa foi realizado para analisar os danos no DNA e a cinética de reparo em linfócitos de pacientes com DA (n=8), indivíduos idosos de mesma idade (n=8) e jovens sadios (n=5; faixa etária entre 18 e 28 anos), cultivados por 48h e tratados com H2O2 por 1h, e analisados em diferentes tempos de recuperação: 0; 0,5; 2 e 6 horas. A análise da expressão gênica por PCR em tempo real mostrou que o gene FANCG, cuja função está relacionada ao controle do ciclo celular e ao reparo do DNA, estava induzido em portadores de DA; o gene CDKN1A, envolvido na resposta a danos no DNA, também se apresentou induzido em portadores de DA. No entanto, não foram observadas alterações com diferenças significativas nos perfis transcricionais dos genes ATM, ATR, FEN1 e MTH1 entre portadores de DA e controles. Em relação às proteínas analisadas, foi observada uma sutil diminuição nos níveis da SOD1 em DA, mas não houve diferenças para ADAM10 e ADAM17. Além disso, observou-se um aumento da expressão da proteína TP53, enquanto a análise da forma fosforilada (serina 15) apresentou baixos níveis de indução. Esses resultados são compatíveis com a ausência de diferença nos níveis de expressão dos genes ATM e ATR. Em relação à análise de indução de danos no DNA e à cinética de reparo, os resultados mostraram diferenças significativas entre os portadores de DA e os controles, o que pode sugerir que os mecanismos envolvidos no processamento do dano oxidativo são diferentes na patologia de Alzheimer quando comparados ao processo de envelhecimento per se. Finalmente, os resultados obtidos sustentam a hipótese de que as vias de reparo do DNA podem estar comprometidas na DA. Além disso, foi mostrado que linfócitos do sangue periférico humano podem refletir pelo menos algumas das alterações associadas à doença, o que incentiva maiores investigações nessas células que possam fornecer biomarcadores com potencial para contribuir na caracterização da DA.Alzheimers disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder that causes a high impact on public health. Although oxidative stress has been associated with the aging process and the pathogenesis of neurodegenerative diseases (including AD), the literature is still scarce regarding the risk factors for the disease and the role of oxidative damage in the development of AD. The purpose of the present work was to study whether lymphocytes of AD patients display alterations in the expression levels of several genes related to stress responses, such as SOD1, TP53, ATM, ATR, FEN1, FANCG, CDKN1A, MTH1; and the genes ADAM10 and ADAM17 directly associated with the pathology. In addition, our objective was to evaluate the levels of DNA damage and repair kinetics in lymphocytes treated with hydrogen peroxide (H2O2). Blood samples were collected from AD patients (age between 65 and 80 years) and elderly individuals in order to analyze protein expression by Western blot (n=6) and transcript expression by quantitative real time PCR (n=7). The comet assay was used to investigate DNA damage and repair kinetics in lymphocytes of AD patients (n=8), elderly age-matched individuals (n=8), and young healthy individuals (n=5; age between 18 and 28 years). In order to accomplish that, lymphocytes were cultured for 47h, treated with H2O2 for 1h, and analyzed at different recovery times: 0, 0.5, 2, and 6h. The analysis of gene expression by real time qPCR showed that FANCG (implicated in cell cycle control and DNA repair) and CDKN1A (involved in the response to DNA damage stimulus) were both up-regulated in AD patients when compared to controls. In contrast, alteration in transcript profiles of ATM, ATR, FEN1, and MTH1 genes were not significantly different between groups of patients and controls. A small decrease in SOD1 protein levels was detected in AD patients; but, the proteins ADAM10 and ADAM17 expression levels was not different. Moreover, the expression of TP53 was increased in AD patients, while only low levels of TP53-phospho-Ser15 could be found; the latter is consistent with the fact that alterations in the expression levels of ATM and ATR were not observed. Regarding the analysis of DNA damage and repair kinetics, results showed significant differences between AD patients and controls, suggesting that the mechanisms involved in the oxidative DNA damage processing are different in the pathology of Alzheimers disease compared to the process of aging itself. Therefore, the results of the present study support our hypothesis that repair pathways may be compromised in AD. In addition, we showed that peripheral lymphocytes may reflect at least some alterations associated to the disease, encouraging further investigation to search for biomarkers present in these cells that might characterize AD