Yeast selection from the biodiversity of Brazilian distilleries for high ethanol content fermentation

O Brasil é o segundo maior produtor e um dos maiores exportadores de etanol no mundo e tal biocombustível tem grande impacto na economia do país. A expectativa é de grande demanda por tal produto, quer pelo crescente consumo interno, como também em decorrência do fim do protecionismo nos Estados Unidos. Portanto, o Brasil deverá produzir mais etanol e a um custo mais reduzido para manter a competitividade frente aos combustíveis fósseis. Dentre as inovações tecnológicas estaria a fermentação com alto teor alcoólico. Contudo, um dos fatores limitantes para a implantação desta tecnologia é a ausência de leveduras apropriadas para tolerar as condições severas impostas por este tipo de fermentação, onde múltiplos estresses são impostos simultaneamente às leveduras. Assim, este trabalho se propôs a selecionar, da biodiversidade de leveduras encontradas nas destilarias brasileiras, linhagens de Saccharomyces cerevisiae com capacidade de conduzir fermentações com alto teor alcoólico e em condições de reciclo celular. A estratégia de seleção consistiu na busca de linhagens com tolerâncias múltiplas, frentes aos estresses etanólico, osmótico, ácido e térmico. Para tal, um total de 525 linhagens, obtidas de diferentes destilarias, foram submetidas a uma seleção para destacar linhagens com múltipla tolerância. Cerca de metade destas linhagens foram submetidas a uma seleção prévia avaliando-se o crescimento (D.O.570nm, durante 24 horas a 30ºC) em meio constituído de mosto misto (melaço e caldo de cana) com 25% de ART, selecionando 200 linhagens. Estas, acrescidas de mais 249 não avaliadas no meio anterior, foram igualmente submetidas a processo seletivo em meio contendo múltiplos estresses (etanólico, osmótico, ácido e térmico). Tal meio foi desenvolvido após avaliações de 26 combinações com os diferentes estresses acima mencionados e com diferentes intensidades. O objetivo foi buscar um meio que melhor discriminasse as tolerâncias das leveduras referencias: as linhagens de Saccharomyces cerevisiae PE-2 e de panificação, com e sem capacidade de implantação no processo industrial, respectivamente. A tolerância foi avaliada pela formação de biomassa (D.O.570nm, durante 24 horas a 30ºC). Assim, tal meio seletivo permitiu a seleção de 34 linhagens com perfis de tolerância igual ou superior ao da linhagem PE-2. Estas linhagens foram, a seguir, avaliadas quanto à viabilidade celular e ao crescimento em fermentações de mosto misto com teores crescentes de açúcares, ao longo de 10 reciclos a 30oC, atingindo teores de etanol de 15 a 16% (v/v). As 10 linhagens com os melhores desempenhos foram submetidas à avaliação final em fermentações simulando condições industriais, em reciclos fermentativos a 32ºC empregando-se mosto misto com teores crescentes de açúcares, permitindo aumentos nos teores de etanol de 11 a 15% (v/v) ao longo dos reciclos. Para esta avaliação final os seguintes parâmetros foram estimados: rendimento em etanol, formação de biomassa e glicerol, teores de açúcares residuais, viabilidade celular, e teores celulares dos carboidratos de reserva (glicogênio e trealose). Pelo menos 4 linhagens mostraram atributos fermentativos superiores ao da linhagem referência (PE-2), permitindo concluir que linhagens capazes de conduzirem a fermentação com alto teor de etanol podem ser obtidas da biodiversidade encontrada no ambiente das destilarias.Brazil is the second largest ethanol producer and one of the leading ethanol exporter in the world, and this biofuel has great impact on the country economy. Huge demand is expected for this product, not only to supply the growing domestic consumption but due to the end of the United States market protectionism. In view of this, Brazil should produce more ethanol and at a lower cost to maintain competitiveness in relation to fossil fuels. One of the technological approaches which emerges is the high ethanol content fermentation. However, one of the limiting factors for this technology is the absence of proper strains to face the very harsh fermentation condition, where several stresses are simultaneously imposed to the fermenting yeast. This work aimed at selecting Saccharomyces cerevisiae strains from the biodiversity of yeasts found in Brazilian distilleries to conduct high ethanol fermentation with cell reuse. The selection strategy was to search for multiple tolerant strains to ethanol, acid, osmotic and thermal stresses. For that, a total of 525 strains, which were obtained from several distilleries, were subjected to a selection in order to highlight multi-tolerant strains. About half of these strains were subjected to a pre-screening procedure to evaluate growth (O.D.570nm, for 24 hours at 30ºC) in medium containing molasses and sugarcane juice (25% TRS), and 200 strains were selected. These 200 strains, together with 249 strains not previously evaluated, were screened in a medium imposing multiple stresses (ethanol, acid, osmotic and thermal). This medium was chosen after assessments of 26 different medium formulations with the above mentioned stresses and with different intensities. The purpose of that was to find a medium which best discriminate the tolerance of the reference yeasts: PE-2 and bakery Saccharomyces cerevisiae strains, with and without ability to persist in the industrial process, respectively. The strain tolerance was evaluated by biomass formation (O.D.570nm, for 24 hours at 30ºC). By this mean 34 strains were selected displaying similar or superior performance in comparison with PE-2 strain. These strains were then assessed for cell viability and growth in cell reuse fermentations (10 cycles), using cane juice/molasses substrates with increasing sugar content, at 30ºC, reaching 15-16% ethanol (v/v). The 10 strains with the best performances were subjected to final evaluation in fermentations simulating the industrial process with cell reuse, at 32ºC, using the same substrate with increasing sugar content, which allowed rises in ethanol content from 11 to 15% (v/v) over the cycles. For this final evaluation, the following parameters were determined: ethanol yield, biomass and glycerol formation, residual sugar levels, cell viability and storage carbohydrate levels (trehalose and glycogen). At least four strains showed superior fermentative attributes to reference strain (PE-2), leading to the conclusion that strains able to conduct high ethanol content fermentations can be obtained from the natural biodiversity found in Brazilian distilleries