Molecular identification of phytoplasmas associated with summer squash yellow and strawberry fruit phyllody

Frequentemente, fitoplasmas têm sido associados com doenças em cucurbitáceas, tanto cultivadas, como silvestres e daninhas. Em abobrinha-de-moita cultivada no Vale do Ribeira, Estado de São Paulo, foi observado superbrotamento de hastes, malformação da parte aérea e folhas deformadas e enrugadas, sugerindo uma possível infecção por fitoplasmas. A associação de fitoplasmas com morangueiro parece ser rara no Brasil. No entanto, nos municípios de Domingos Martins e Santa Maria de Jetibá, Estado do Espírito Santo, foram observadas plantas de morango apresentando expressiva filodia de frutos, sintoma suspeito de infecção por fitoplasmas. O presente trabalho teve por objetivos detectar e identificar molecularmente os possíveis fitoplasmas associados às plantas doentes. O DNA total das amostras, extraído com um kit comercial ou pelo protocolo 2X CTAB, foi amplificado por dupla PCR com os primers universais P1/Tint e R16F2n/R16R2. Os produtos amplificados com o primeiro par de primers foram reamplificados usando os pares R16(I)F1/R16(I)R1 e R16(III)F2/R16(III)R1, visando a identificação e os produtos de dupla PCR, amplificados com o segundo par de primers, utilizados na análise por RFLP e no sequenciamento. Para as análises filogenéticas adotaram-se seqüências nucleotídicas de fitoplasmas pertencentes a diversos grupos. Observações feitas ao microscópio eletrônico de transmissão revelaram a presença de corpúsculos pleomórficos típicos de fitoplasmas no floema de morangueiro. Por dupla PCR com os primers universais, foi consistentemente detectada a presença de fitoplasmas nos tecidos das plantas doentes. Com o uso dos primers específicos foi possível a identificação de um fitoplasma afiliado ao grupo 16SrIII em abobrinha-de-moita e de fitoplasmas afiliados aos grupos 16SrI e 16SrIII em morangueiro. A análise por RFLP confirmou os resultados obtidos com os primers específicos e demonstrou a presença de um fitoplasma afiliado ao grupo 16SrXIII nas amostras de morangueiro. O sequenciamento permitiu a obtenção de duas seqüências a partir das amostras de morangueiro. A primeira seqüência nucleotídica, SFP-Br1 (EU719107), apresentou 99% de similaridade com as seqüências dos fitoplasmas afiliados ao grupo 16SrIII e a análise filogenética mostrou um maior relacionamento com o subgrupo 16SrIII-B. A segunda seqüência nucleotídica, SFP-Br-3 (EU719109), apresentou 98% de similaridade com as seqüências dos fitoplasmas afiliados ao grupo 16SrXIII. A análise filogenética mostrou este fitoplasma como um representante do grupo 16SrXIII, porém localizado em um novo ramo, diverso daqueles conhecidos para representantes deste grupo. Os coeficientes de similaridade calculados para SFP-Br3 e para os subgrupos 16SrXIII-A, 16SrXIII-B e 16SrXIII-C variaram de 0,91 a 0,96, o que distinguiu o fitoplasma presente no morangueiro dos outros subgrupos de fitoplasmas afiliados ao grupo 16SrXIII já existentes. Assim, através de análise molecular, foi possível relatar a abobrinha-de-moita como um novo hospedeiro de fitoplasmas do grupo 16SrIII, bem como detectar e identificar distintos fitoplasmas nas plantas de morango, inclusive um novo representante, aqui denominado de 16SrXIII-D.Phytoplasmas have been associated with some diseases of cucurbit as cultivated as sylvester and weed species. Symptoms of witches broom and leaf malformation were observed in summer squash cultivated in the Vale do Ribeira, São Paulo State, suggesting infection by phytoplasma. The association of phytoplasmas with strawberry diseases seems to be rare in Brazil. Nevertheless, in Domingos Martins and Santa Maria de Jetibá cities, located in Espirito Santo State, strawberries plants with expressive fruit phyllody were observed. This kind of symptom also suggested infection associated to phytoplasma. So, the present work was conducted in order to detect and identify possible phytoplasmas associated to simptomatic plants through molecular analysis. The DNA, extracted with a commercial kit or through 2X CTAB protocol, was amplified by nested PCR with universal primers P1/Tint and R16F2n/R16R2. The amplified products with the first primers pairs were reamplified using the primers R16(I)F1/R16(I)R1 and R16(III)F2/R16(III)R1 for specific identification; and the products of nested PCR, amplified from second primers pair, were submitted to RFLP analysis and to sequencing. For phylogenetic analysis were included sequences of phytoplasmas belonging to many groups. Results showed that pleomorphic bodies were present in the phloem of diseased strawberries plants, by using electronic microscopy. The amplifications by nested PCR with universal primers allowed the detection of phytoplasmas in the tissues of symptomatic strawberry and squash plants. PCR assays with specific primers revealed a phytoplasma of 16SrIII group in summer squash and phytoplasmas of 16SrI and 16SrIII groups in strawberry plants. RFLP analysis confirmed the occurrence of a member of 16SrIII group in summer squash and demonstrated the presence of phytoplasmas affiliated to 16SrI, 16SrIII and 16SrXIII groups in strawberry samples. The sequencing allowed the attainment of two sequences from strawberries samples. The first sequence, designated SFP-Br1 (EU719107) representing a phytoplasma affiliated to 16SrIII group, showed 99% of similarity with other sequences of phytoplasmas affiliated with this group. The phylogenetic analysis showed that this phytoplasma was more related with the subgroup 16SrIII-B. The second sequence, designated SFP-Br3 (EU719109) representing a phytoplasma affiliated to 16SrXIII group, showed 98% of similarity with members of this group. The phylogenetic analysis revealed this phytoplasma belonging to 16SrXIII group, but located on a new different branch from those previously known. The similarity coefficient indicated variations between SFP-Br3 and the three phytoplasmas affiliated to 16SrXIII-A, 16SrXIII-B and 16SrXIII-C sub-groups, varying on 0.91 to 0.96, distinguishing the strawberry phytoplasma from the other sub-groups of phytoplasma affiliated with the 16SrXIII group already existing. This way, through molecular analysis, it was possible to relate summer squash as a new host of 16SrIII group phytoplasma, as well as detecting and identifying distinct phytoplasmas on strawberry plants and characterize a new 16SrXIII-D subgroup