Simultaneous detection of bovine Coronavirus and group A Rotavirus in bovine fecal samples by a multiplex semi-nested RT-PCR

O coronavírus bovino (BCoV) e rotavírus (RV) são importantes agentes da diarréia neonatal bovina, causando grandes perdas econômicas. O BCoV é também responsável pela disenteria de inverno em vacas adultas e por desordens respiratórias e o RV possui um aspecto zoonótico de importância na saúde pública. Este estudo teve o objetivo de desenvolver uma multiplex hemi-nested RT-PCR para detecção simultânea de BCoV e RV do grupo A com a utilização de um controle interno. Para tanto, foram desenhados três primers dirigidos ao gene N de BCoV (306pb) e três primers dirigidos ao gene VP1 do RV do grupo A (228pb); para o controle interno, foram utilizados dois primers dirigidos ao mRNA do gene mitocondrial bovino ND5 (191pb). Foram utilizados como controles positivos a amostra Kakegawa de BCoV (título HA de 256), a amostra 8209 de rotavírus do grupo A (título viral de 101.66TCID50%/200µL) e suspensão de células MDBK para o controle interno. A extração de RNA foi realizada com o reagente comercial TRIzol, de acordo com as recomendações do fabricante. Foram realizados gradientes de temperatura para a determinação da temperatura ótima de hibridação para cada par de primers, resultando em 50ºC para PCR e 55ºC para a hemi-nested. Doze protocolos com diferentes concentrações de Taq DNA polymerase, MgCl2, primers e DNA-alvo foram testados. Para determinação do limiar de detecção, o protocolo final foi utilizado em diluições dos dois vírus em suspensão de amostras fecais negativas para BCoV e RV adicionadas de 10% de suspensão de células MDBK, obtendo o limiar de detecção de 10-8 para os dois vírus e aplicado em amostras fecais de bezerros (53) e vacas adultas (22). Todas as amostras foram previamente testadas para BCoV por uma nested RT-PCR dirigida ao gene RdPd, sendo 15 positivas, e para rotavírus pela PAGE, sendo 3 positivas. Para a multiplex, 15 amostras foram positivas para BCoV e 6 para rotavírus. O seqüenciamento de DNA das amostras positivas para multiplex demonstrou a especificidade do teste. Uma concordância ótima foi encontrada para BCoV (0,833) e substancial para rotavírus (0,648) calculada pela estatística kappa, comparando-se com os testes de referência. Estes resultados demonstram que a padronização da multiplex foi eficiente para a detecção de BCoV e RV, com elevadas sensibilidade e especificidade. Além disso, o diagnóstico simultâneo dos dois agentes permite um diagnóstico rápido e a um menor custo devido à utilização de reduzidas quantidades de reagentes e mão de obra, fornecendo uma importante ferramenta para o diagnóstico e estudo da etiologia da diarréia em bovinos.Bovine coronavirus (BCoV) and rotavirus (RV) are important agents of neonatal diarrhea in cattle, causing large economic losses. BCoV is also responsible for winter dysentery in adult cattle and respiratory disorders and RV has a zoonotic aspect of importance in public health. This study aimed to develop a multiplex hemi-nested RT-PCR for simultaneous detection of BCoV and RV of group A with an internal control. For this purpose, three primers were designed targeting the N gene of BCoV (306pb) and three primers targeting to the VP1 gene of group A RV (228pb); for internal control, two primers targeting to the mRNA of ND5 bovine mitochondrial gene (191pb) were used. Positive controls were BCoV Kakegawa strain (HA titer 256), group A bovine rotavirus strain 8209 (viral titer of 101.66TCID50%/200µL), and MDBK cells suspension for internal control. The RNA extraction was performed with the commercial reagent TRIzol. Temperature gradients were carried out for each primers pair for the determination of the optimal hybridization temperatures, resulting in 50°C for PCR and 55°C for the hemi-nested. Twelve protocols were tested with different concentrations of Taq DNA polymerase, MgCl2, primers and target DNA. The final protocol was used in 10-fold dilutions of the two viruses in suspension of fecal sample negative for BCoV and RV added to 10% of MDBK cells suspension, obtaining the detection limit of 10-8 for the two viruses, and applied to 75 fecal samples from calves (53) and cows (22). All samples were previously tested for BCoV by a nested RT-PCR to RdPd gene, being 15 positive; and for rotavirus by PAGE, being 3 positive. For multiplex, 15 samples were positive for BCoV and 6 for RV. The DNA sequencing of multiplex-positive samples substantiates the specificity of the test. A great agreement was found for BCoV (0.833) and substantial for RV (0.648) by calculating the kappa statistic in comparison to the reference tests. These results demonstrate that the multiplex standard was effective in the detection of BCoV and RV, with high sensitivity and specificity. In addition, simultaneous diagnosis of both agents allows a faster and at lower cost diagnosis due to use of smaller quantities of reagents and labor, providing an important tool for the diagnosis and study on the etiology of diarrhea in cattle