Effects of benzodiazepines on rat neutrophil activity measured by flow cytometry

Benzodiazepínicos (BDZ) são fármacos ansiolíticos que se caracterizam por atuar em receptores GABAa presentes no sistema nervoso central. Além dos receptores centrais os BDZ também possuem afinidade por sítios ligantes periféricos presentes em vários tecidos, dentre eles nas glândulas adrenais e em células polimorfonucleares. O presente experimento analisou os efeitos de BDZ sobre a atividade de neutrófilos e sobre os níveis séricos de corticosterona de ratos. Especificamente, o burst e a fagocitose de neutrófilos foram estudados após o tratamento ex vivo e in vitro com diazepam, RO 5-4864, clonazepam e/ou PK 11195. Os efeitos do diazepam sobre a atividade de neutrófilos também foram avaliados após o uso prolongado deste fármaco. Finalmente, os efeitos in vitro dos BDZ foram estudados após a incubação com um bloqueador do canal de cálcio (Ca2+) o L-verapamil. Os resultados mostraram que (1) o tratamento agudo ex vivo com diazepam (10 mg/kg) produziu um aumento do burst oxidativo e da fagocitose induzida por PMA, LPS e Staphylococcus aureus; (2) o tratamento prolongado (21 dias) com diazepam (10 mg/kg) produziu um aumento do burst oxidativo induzido pelos mesmos estímulos e reduziu a fagocitose dos neutrófilos (porcentagem e intensidade); (3) o tratamento agudo ex vivo com diazepam, mas não o prolongado, aumentou os níveis séricos de corticosterona; (4) os efeitos da adição in vitro de diazepam (100 nM) foram na mesma direção daqueles observados após o tratamento agudo; (5) o RO 5-4864 (100 nM) induziu in vitro efeitos similares aos obtidos ex vivo (10 mg/kg) e in vitro (100 nM) com diazepam; (6) o tratamento ex vivo com clonazepam (10 mg/kg) diminuiu o burst oxidativo de neutrófilos induzido por PMA, LPS e Staphylococcus aureus enquanto que o tratamento com este fármaco na dose de 1 mg/kg aumentou o burst oxidativo destas células frente a todos os estímulos; (7) o tratamento ex vivo (1 e 10 mg/kg) e in vitro (100 nM) com clonazepam não alterou a fagocitose de neutrófilos; (8) os efeitos da adição in vitro de clonazepam sobre a atividade de neutrófilos vão na mesma direção daqueles observados após o tratamento ex vivo na dose de 1 mg/kg; (9) o clonazepam (1 e 10 mg/kg) aumentou os níveis séricos de corticosterona; (10) a adição in vitro do PK 11195 (100 nM) per se ou associado com diazepam (100 nM) ou RO 5-4864 (100 nM) aumentou o burst oxidativo e diminuiu a fagocitose realizada pelos neutrófilos; (11) a adição in vitro do PK 11195 (100 nM) associado com o clonazepam (100 nM) diminuiu o burst oxidativo induzido por PMA e diminuiu a fagocitose realizada por estas células; finalmente, (12) a pré incubação por 2 minutos com L-verapamil (100 nM) bloqueou todos os efeitos do diazepam sobre a atividade de neutrófilos estimulada por PMA, LPS e Staphylococcus aureus e reverteu os efeitos do RO 5-4864 no burst oxidativo induzido por PMA. Esses resultados sugeriram que os efeitos dos BDZ não estão relacionados com a ativação de PBR nas células da glândula adrenal e também que eles não estão relacionados a um aumento dos níveis séricos de corticosterona. Indicaram que os BDZ tenham produzido mudanças na concentração do Ca2+ intracelular dos neutrófilos através da ativação de PBR seguida de um aumento da permeabilidade da membrana plasmática ao Ca2+ através da abertura de canais sensíveis ao L-verapamil, permitindo a entrada do Ca2+. Os diferentes efeitos dos BDZ sobre o burst oxidativo e a fagocitose de neutrófilos foram atribuídos a ações específicas deste fármaco em subtipos de PBR presentes nos neutrófilos e nas membranas mitocondriais. Finalmente, os resultados sugeriram o desenvolvimento de tolerância aos efeitos do diazepam sobre os níveis séricos de corticosterona mas não sobre a atividade de neutrófilos.Benzodiazepines (BDZ) exert their anxiolytic effects via specific binding sites coupled to neuronal GABAa receptors. They also affect a second, pharmacologically different type of receptor, which has been found in many sites such as blood polimorphonuclear cells and adrenals. The present experiment was designed to analyze the effects of BDZ on neutrophil activity and corticosterone serum levels in rats. Specifically, neutrophil oxidative burst and phagocytosis were studied after ex vivo and in vitro treatments with diazepam, Ro 5-4864, clonazepam and/or PK 11195. Diazepam effects on neutrophil activity were also taken after long-term treatment. Finally, in vitro effects of BDZ were studied after incubation with L-verapamil, a Ca2+ channel blocking agent. Results showed that (1) acute and ex vivo diazepam (10.0 mg/kg) treatment induced an increment on PMA, LPS and Staphylococcus aureus induced oxidative burst and phagocytosis (2) long-term (21 days, 10 mg/kg/day) diazepam treatment increased the oxidative burst induced by the same stimuli and reduced both intensity of phagocytosis and the percentage of neutrophil performing phagocytosis; (3) acute and ex vivo diazepam treatment, but not long-term diazepam treatment increased corticosterone serum levels; (4) the effects induced by in vitro addition of diazepam (100 nM) were in the same direction of those observed after acute treatment; (5) Ro 5-4864 (100 nM) induced similar effects to those of diazepam after ex vivo (10.0 mg/kg) and in vitro (100 nM) treatments; (6) ex vivo (10.0 mg/kg) clonazepam treatment decreased the neutrophil oxidative burst induced by PMA and S. aureus after a 1.0 mg/kg dose and decreased these parameters after a higher (10 mg/kg) dose; (7) ex vivo (1.0 and 10.0 mg/kg) and in vitro (100 nM) clonazepam treatments did not change neutrophil phagocytosis; (8) in vitro clonazepam (100 nM) induced effects on neutrophil activity that were in the same direction of those observed after the 1.0 mg/kg dose (9) clonazepam (1.0 and 10.0 mg/kg) increased corticosterone serum levels; (10) in vitro PK 11195 (100 nM) per se or associated with diazepam (100 nM) or Ro 5-4864 (100 nM) increased PMA, LPS and S. aureus induced neutrophil oxidative burst and decreased cell phagocytosis; (11) in vitro PK 11195 (100 nM) together with clonazepam (100 nM) decreased PMA-induced oxidative burst and decreased S. aureus phagocytosis; finally, (12) in vitro L-verapamil (100 nM) incubation for 2 minutes prevented all effects induced by diazepam on PMA, LPS and S. aureus -induced neutrophil activity and reverted the effects induced by Ro 5-4864 (100 nM) on PMA-induced oxidative burst. These results suggest that BDZ effects on neutrophil activity were not related to PBR activation within the adrenal gland cells, leading to increments on corticosterone serum levels. They suggest instead that BDZ induced [Ca2+]i changes in neutrophils through PBR activation followed by an increase in plasma membrane permeability due to L-verapamil sensitive Ca2+ channels and subsequent extracelular Ca2+ entry. The differences of BDZ effects on neutrophil oxidative burst and phagocytosis were attributed to specific actions on different PBR subtypes present on neutrophil and mitochondrial membranes. Finally, results suggest the development of tolerance to diazepam effects on corticosterone serum levels but not on neutrophil activity