In vitro assay of nitrate reductase enzyme and effect of nitrate and phosphate availability in colour strains of Hypnea musciformis (Wulfen) J. V. Lamour. (Gigartinales, Rhodophyta)

A enzima nitrato redutase (NR) catalisa a redução do nitrato a nitrito e controla a taxa de assimilação do nitrato. O ensaio in vitro da nitrato redutase foi otimizado para a linhagem selvagem (marrom, MA) e para a linhagem deficiente em ficoeritrina (verde-clara, VC) de Hypnea musciformis. As duas linhagens foram cultivadas em temperatura de 23 ± 2°C, fotoperíodo de 14 horas, irradiância de 60-90µmol fótons m-2s-1, e meio composto por água do mar esterilizada (30ups) enriquecida com a solução de von Stosch na concentração de 50% (VSES/2). As condições ótimas de ensaio para ambas as linhagens foram: 40µM de NADH; 10min de incubação do extrato bruto (EB) e 100µL de EB. A atividade ótima da NR ocorreu em 4 e 2mM de nitrato para a linhagem VC e MA, respectivamente. As linhagens VC e MA apresentaram, respectivamente, constante aparente de Michaelis-Menten (K M) para NADH de 0,2068 e 0,0837 µM, e K M para nitrato de 0,0492 e 0,0294mM. Os resultados indicam que a NR da linhagem MA tem maior afinidade pelo substrato do que a NR da linhagem VC de H. musciformis. Os experimentos para avaliar os efeitos da disponibilidade de nitrato (5 a 105µM) e nitrato e fosfato (0,5 a 25,5µM, com a relação N:P de 4:1) mostraram que a atividade da NR das linhagens VC e MA não aumentou com a adição de nitrato no meio, o que pode estar relacionado com o estado nutricional dessas algas. A atividade da NR foi maior nos tratamentos com adição de fosfato do que naqueles com adição de apenas nitrato, indicando que esse nutriente é importante para os processos metabólicos relacionados a atividade da NR.The enzyme nitrate reductase (NR) catalyzes the reduction of nitrate to nitrite and controls the rate of nitrate assimilation. The in vitro assay of NR was optimized for the wild strain (brown, MA), and the phycoerythrin-deficient strain (light-green, VC) of Hypnea musciformis. Both strains were cultured at temperature of 23 ± 2°C, photoperiod of 14h, irradiance of 60-90 µmol photons m-2s-1, with medium composed by sterilized seawater (salinity 30 psu) with 50% von Stosch's enrichment solution (VSES/2). The optimal conditions for in vitro assay of NR were: 40µM of NADH; 10min of incubation of crude extracts (EB), and 100µL of EB to both strains. Optimal activity of NR occurred at 4 and 2mM of nitrate to the VC and MA strains, respectively. The VC and MA strains showed, respectively, Michaelis-Menten constants (K M) for NADH of 0.2068 and 0.0837µM, and K M for nitrate of 0.0492 and 0.0294mM. The results indicate that the NR of MA strain has higher affinity by the substrate than the NR of VC strain of H. musciformis. Experiments on the effects of availabilities of nitrate (5 to 105µM) and nitrate and phosphate (0.5 to 25.5µM, with a N:P relation of 4:1) showed that NR activity of VC and MA strain did not increase with the addition of nitrate to the medium, what can be related with their nutritional state. The NR activity was higher in treatments with phosphate addition than those with only nitrate addition, indicating that this nutrient is important to metabolic processes related to the NR activity