Caracterização molecular de uma fosfotransferase (Arginina Quinase) de Trypanosoma rangeli

TCC(graduação) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas. Biologia.O Trypanosoma rangeli é um parasito hemoflagelado que infecta mamíferos silvestres e domésticos, assim como seres humanos. Compartilha reservatórios e vetores com Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da Doença de Chagas. Dentre as muitas proteínas cruciais no metabolismo de tripanosomatídeos, a enzima arginina quinase (AK), pertencente a uma família de proteínas conservadas com atividade de fosfotransferase (guanidino quinases), cataliza a interconversão entre a fosfoarginina e ATP, atuando como reguladora de reservas energéticas sob condições de estresse por falta de nutrientes. O objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização biológica e molecular da proteína AK de T. rangeli (TrAK). A sequência do gene TrAK foi amplificada através de PCR, gerando um produto esperado de 1.070 pb. Após clonagem em vetor pGEM T-easy®, o sequenciamento do inserto confirmou sua identidade e revelou que o gene da AK de T. rangeli possui 89 % de similaridade com o gene ortólogo de T. cruzi. Visando a expressão heteróloga da TrAK, o gene foi sub-clonado em vetor de expressão pET-14b, sendo este utilizado na transformação de E. coli BL21(DE3) Codon plus. Após indução, detectou-se em SDS-PAGE a expressão de uma proteína de ~40 kDa nas frações solúvel e insolúvel do extrato bacteriano, tamanho este compatível ao esperado teórico. A proteína recombinante (rTrAK) foi purificada da fração solúvel (rendimento = 338 mg/l de cultura) e sua identidade confirmada por espectrometria de massas (Nano-LC ESI-MS/MS) com 74 % de cobertura. Camundongos C57BL/6 foram imunizados com rTrAK produzindo um antissoro anti-TrAK espécie-específico que foi capaz de reconhecer um polipeptídeo de 45 kDa no extrato proteico total de formas epimastigotas e tripomastigotas do T. rangeli, não reconhecendo nenhuma proteína em extratos de T. cruzi. Nos ensaios de citolocalização a TrAK pode ser encontrada principalmente em associação com o flagelo. Os ensaios apresentados neste trabalho mostraram que a proteína TrAK possui características similares a TcAK e a TbAK1, porém vale ressaltar que ensaios de atividade e outros estudos subsequentes devem ser feitos para obtenção de maiores informações a respeito da atividade da enzima TrAK.Trypanosoma rangeli is a hemoflagellate parasite that infects wild and domestic mammals, as well as the man. It shares hosts, reservoirs and vectors with Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. Among the proteins that are crucial in the metabolism of trypanosomatids, the enzyme arginine kinase (AK) belongs to a family of conserved proteins with phosphotransferase activity (guanidino kinases) and catalyzes the interconversion between phosphoarginine and ATP, acting as a manager of energy reserves under stress from lack of nutrients. Thus, the aim of this work was the molecular characterization of the protein AK from T. rangeli (TrAK). The TrAK gene sequence was amplified by PCR, generating an expected product of 1.070 bp. After cloning in pGEM T-easy® vector, sequencing confirmed the identity of the insert revealed that T. rangeli AK has 89 % similarity with the orthologous gene of T. cruzi. Targeting the expression of heterologous TrAK, the insert was sub- cloned into the expression vector pET -14b, which is used in the transformation of E. coli BL21 (DE3) Codon Plus. After induction, the expression of a protein of ~40 kDa in soluble and insoluble fractions was detected in SDS-PAGE, the theoretical expected size. The recombinant protein (rTrAK) was purified from the soluble fraction (yield = 338 mg/l of bacterial culture) and has it identity confirmed by mass spectrometry (nano-LC ESI-MS/MS) (74 % coverage). C57BL / 6 mice were immunized with rTrAK producing an anti-TrAK species-specific antiserum that was able to recognize a polypeptide of 45 kDa in total protein extract of epimastigotes and trypomastigotes of T. rangeli, and it does not recognize any protein in extracts of T. cruzi. In the tests of the subcellular location, the TrAK can be found mainly in association with the flagellum. The tests presented in this work showed that the protein TrAK has similar characteristics to TcAK and TbAK1, but it is noteworthy that testing activity and other subsequent studies should be made to obtain more information about the activity of the enzyme TrAK