Desenvolvimento de métodos analíticos em GC-FID, CE-UV e LC-MS/MS no estudo fitoquímico de triterpenos, flavonóis e taninos voltado para a obtenção de uma nova cultivar de Maytenus ilicifolia (espinheira-santa)

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2014.Esta tese tem como proposta principal o desenvolvimento de novos métodos analíticos para a determinação de três subclasses de metabólitos secundários (triterpenos, flavonóis e taninos), presentes em 111 indivíduos de Maytenus ilicifolia (espinheira-santa) contidos em um Banco Ativo de Germoplasma (BAG). A determinação dos triterpenos, friedelan-3-ol e friedelin, em extratos de M. ililifolia, foi realizada em um cromatografo gasoso com detector de ionização em chama (GC-FID, do inglês gas chromatography with flame ionization detector) e teve como principal objetivo, aumentar a frequência instrumental empregando, pela primeira vez, injeções múltiplas em uma única corrida (MISER, do inglês multiple injections in a single experimental run). Foi possível realizar três injeções de indivíduos diferentes dos extratos de M. ilicifolia em uma mesma corrida, utilizando o método com MISER, cujo tempo de análise foi inferior a dez minutos. Observou-se um aumento na frequência instrumental com um fator de 2,5 vezes quando comparado com o método de injeção simples. Este método empregando MISER apresentou resultados satisfatórios para os parâmetros de validação e a concentração de friedelan-3-ol variou entre 2,8-3,7 mg g-1 e para friedelin entre 2,3-2,5 mg g-1. A determinação de flavonóis com o auxílio do planejamento de experimentos (DOE, do inglês design of experiment) foi realizada em um eletroforese capilar de zona com detector de ultravioleta-visível (CZE-UV/Vis, do inglês capillary zone electrophoresis with ultraviolet-visible detector). O método mostrou-se eficiente para a separação dos analitos com um tempo de análise inferior a três minutos. O emprego do DOE permitiu otimizar os procedimentos de preparo de amostra e de separação eletroforética. Os parâmetros de validação do método demonstraram bons resultados, e pela primeira vez, a determinação dos flavonóis glicosilados a partir das agliconas, quercetina e canferol, permitiu avaliar as diferentes concentrações dos flavonóis em distintos indivíduos de M. ilicifolia, cujas concentrações variaram entre 0,29-0,33 mg g-1 para o canferol e 0,25 - 0,32 mg g-1 para a quercetina. A avaliação qualitativa dos taninos presentes em diferentes indivíduos de M. ilicifolia foi realizada utilizando a técnica de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em ?tandem? (LC-MS/MS, do inglês liquid chromatography tandem mass spectrometry detector), a qual permitiu identificar 13 analitos quando comparados com dados apresentados na literatura. A fim de quantificar estes compostos, utilizou-se o método spectrofotométrico da vanilina e a concentração dos taninos nos diferentes indivíduos analisados variou entre 7,7 a 11,6 mg g-1. Os métodos desenvolvidos permitiram avaliar uma grande quantidade de amostras de M. ilicifolia, as quais foram submetidas às mesmas condições ambientais (climáticas e geográficas). Este trabalho permitiu ainda avaliar que os diferentes metabólitos secundários presentes em extratos de folhas de M. ilicifolia não apresentavam correlação com a morfologia foliar quanto à presença de acúleos (espinhos), facilitando a escolha de espécies para o desenvolvimento de uma nova cultivar.<br>Abstract : This thesis is mainly aimed at the development of new analytical methods for the determination of three subclasses of secondary metabolites (triterpenes, flavonols, and tannins) present in 111 different individuals from Maytenus ilicifolia (espinheira-santa) contained in an active germplasm bank (BAG). The determination of triterpenes, friedelan-3-ol and friedelin, in extracts of M. ililifolia were performed on a gas chromatograph with flame ionization detector (GC-FID) and aimed to increase the frequency employing instrumental, for the first time, multiple injections in a single run (MISER). It was possible to perform three different injections of extracts of M. ilicifolia in the same run, using the method with MISER, whose analysis time was less than ten minutes. There was an increase in instrumental frequency by a factor of 2.5 times when compared to the single injection method. MISER employing this method has produced satisfactory results for the validation parameters and the concentration of friedelan-3-ol ranged from 2.8 to 3.7 mg g-1 and friedelin between 2.3-2.5 mg g-1. The determination of flavonols with assistance from design of experiments (DOE) was performed on a capillary zone electrophoresis with UV-Visible detector (CZE-UV/VIS). The method proved to be efficient for the separation of analytes with a analysis time of less than three minutes. The uses of DOE allowed optimize procedures for sample preparation and electrophoretic separation. The validation parameters of the method showed good results and the determination of flavonol glycosides from the aglycones, quercetin and kaempferol, allowed to study different concentrations of flavonols in different individuals of M. ilicifolia, whose concentrations ranged from 0.29 to 0 33 mg g-1 for kaempferol and 0.25 to 0.32 mg g-1 for quercetin. Qualitative evaluation of tannins present in different individuals from M. ilicifolia was performed using liquid chromatography coupled to mass spectrometry in "tandem" (LC-MS/MS), which allowed the identification of 13 analytes as compared to data shown in literature. In order to quantify these compounds, it was used the spectrophotometric method vanillin and tannin concentration subjects ranged from 7.7 to 11.6 mg g-1. The developed methods allowed evaluating a large number of samples of M. ilicifolia, which were subjected to the same environmental conditions (climate and geography). This study allowed evaluating the secondary metabolites present in extracts of leaves of M. ilicifolia showed no correlation with the leaf morphology and the presence of thorns, facilitating the choice of the species for the development of a new cultivar