Análise da interação de Azospirillum brasilense FP2 com raízes de milho (Zea mays) por qPCR, microscopia eletrônica e proteômica

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2014.As rizobactérias promotoras de crescimento vegetal (RPCV) são um grupo de micro-organismos benéficos às plantas devido à sua capacidade de estimular o crescimento vegetal através de vários processos. Uma das mais importantes e estudadas RPCV é a Azospirillum brasilense, uma diazotrófica associada com importantes culturas tais como milho e trigo, a qual possui ampla distribuição geográfica e tem sido usada como organismo modelo para investigar a promoção do crescimento vegetal associativo. Vários mecanismos estão envolvidos na promoção do crescimento vegetal por A. brasilense, entre eles: capacidade de fixação biológica de nitrogênio e à produção de fitormônios, os quais levam à formação de raízes laterais e, consequentemente, à melhor adsorção de água e minerais e, à maior tolerância a estresses, promovendo efeitos positivos sobre os mecanismos de defesa. Neste trabalho foram avaliados parâmetros de crescimento de duas variedades de milho Dekalb 240 (DKB240) e Pioneer 30F53 (P30F53), crescimento bacteriano nas raízes e perfil de proteínas em uma variedade (P30F53) quando as plântulas foram crescidas in vitro. Realizou-se a detecção e quantificação por PCR em tempo real de A. brasilense em plântulas de duas variedades de milho. Os iniciadores foram desenhados e sua especificidade foi verificada usando DNA de 12 diferentes espécies de bactérias. Os resultados dos experimentos de qPCR apresentaram valores dentro da variação aceitável para qPCR, eficiência média de 95% e coeficiente de correlação de 0,98, indicando que o gene nifA é adequado para a análise quantitativa do genoma alvo bacteriano. O número de cópias de DNA bacteriano por grama de massa fresca de raiz aumentou de 3,3 x 106 (1 DAI) para 5,3 x 109 (10 DAI) quando raízes inoculadas de milho da variedade DKB240 foram analisadas e, da mesma maneira, variando de 6 x 106 (1 DAI) para 6,8 x 109 (10 DAI) na variedade P30F53 quando cultivadas in vitro. Os iniciadores desenvolvidos visando nifA serão úteis para monitorar Azospirillum brasilense FP2 em culturas no sistema solo-planta. Comparando-se plântulas da variedade P30F53, controle e inoculadas com A. brasilense FP2, foram encontradas diferenças significativas 7 dias após a inoculação (DAI) em 7 dos 8 parâmetros avaliados (massa fresca e tamanho da folha, massa fresca e tamanho da raiz principal, número de raízes laterais, massa fresca e número de raízes adventícias e massa fresca total das raízes). A observação de raízes através da microscopia eletrônica de varredura (MEV) mostrou que A. brasilense FP2 se liga à superfície radicular, tanto na região do ápice quanto do terço médio, e podem ser encontradas como células simples ou agregadas. A análise do perfil de proteínas, obtido através da técnica de eletroforese bidimensional (2DE), revelou 46 spots diferencialmente acumulados em raízes de milho da variedade Pioneer 30F53 inoculadas com A. brasilense FP2. Os spots foram analisados por espectrometria de massa e três proteínas apresentaram homologia com proteínas hipotéticas de milho e arroz.<br>Abstract : The plant growth promoting bacteria (PGPB) are a group of microbes beneficial to plants due to its ability to stimulate plant growth by various processes. One of the most important and studied PGPB Azospirillum brasilense is a diazotrophic associated with major crops such as corn and wheat, which widely spread and has been used as a model organism to investigate the associative plant growth promotion. Several mechanisms are involved in the promotion of plant growth by A. brasilense, including: the ability of biological nitrogen fixation and production of phytohormones, which leads to the formation of lateral roots and thus the better absorption of water and minerals, greater tolerance to stress, have positive effects on the mechanisms of defense. In this work, the growth parameters of two varieties of corn Dekalb 240 (DKB240) and Pioneer 30F53 (P30F53), bacterial growth in roots and protein profile in a variety (P30F53) when seedlings were grown in vitro were evaluated. We carried out the detection and quantification by real time PCR A. brasilense seedlings in the two varieties of corn. Primers were designed and their specificity was verified using DNA from 12 different bacterial species. qPCR efficiency and correlation coefficient presented values within the acceptable range for qPCR, average efficiency of 95% and a correlation coefficient of 0.98, indicating that the nifA gene is suitable for the quantitative analysis of target bacterial genome. Bacterial DNA copy number per gram of fresh root increased from 3.3 x 106 (one DAI) to 5.3 x 109 (ten DAI) when inoculated maize roots of DKB 240 variety were analyzed and, in the same way, it ranged from 6 x 106 (one DAI) to 6.8 x 109 (ten DAI) in P30F53 variety when cultured in vitro. The primers developed targeting nifA gene will be useful for monitoring Azospirillum brasilense growth in crops. Comparing control seedlings (variety Pioneer 30F53) inoculated with A. brasilense FP2, significant differences were observed 7 days after inoculation (DAI) in 7 out to 8 evaluated parameters (fresh weight and leaf size, fresh weight and size of the main root, lateral root number, fresh weight and number of adventitious roots and total fresh weight of roots). The observation of roots by scanning electron microscopy (SEM) showed that A. brasilense FP2 binds to the root surface, both in the region of the apex and the middle third, and may be found as single cells or aggregated. Analysis of the protein profile obtained using the technique of two-dimensional electrophoresis (2DE) revealed 46 proteins differentially accumulated in roots of maize (variety Pioneer 30F53) inoculated with A. brasilense FP2. The spots were analyzed by mass spectrometry and three proteins presented homology with hypothetic proteins from corn and rice