Interação entre a bactéria promotora de crescimento vegetal Herbaspirillum seropedicae cepa SmR1 e plantas de milho inoculadas: quantificação de DNA bacteriano por qPCR

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2014.O elevado uso de fertilizantes na agricultura vem ocasionando diversos problemas ambientais, tais como eutrofização de rios e mananciais, volatilização e escoamento superficial. Com o objetivo de diminuir a utilização de fertilizantes na agricultura, principalmente os nitrogenados, tem-se utilizado as bactérias promotoras de crescimento vegetal (BPCV), as quais quando em associação com as plantas, promovem o crescimento através da produção e secreção de fitormônios, proteção do hospedeiro contra fitopatógenos e realizam a fixação biológica de nitrogênio. São encontradas atualmente diversas espécies de BPCV capazes de estabelecer associação com plantas, dentre estas destaca-se Herbaspirillum seropedicae como um importante microrganismo endofítico capaz de estabelecer associação com diversas culturas de importância econômica, tais como milho, arroz, sorgo, trigo e cana de açúcar. A bactéria H. seropedicae cepa SmR1 é um mutante espontaneamente resistente ao antibiótico estreptomicina e teve seu genoma sequenciado e publicado em 2011. Com o avanço na utilização destas bactérias como promotoras de crescimento, métodos para detectar e quantificar a presença destes organismos endofíticos são necessários. Neste sentido, este trabalho teve por objetivo o desenvolvimento de iniciadores específicos para identificação e quantificação da BPCV H. seropedicae cepa SmR1 em plantas de milho inoculadas, através da técnica de PCR em Tempo Real. Foram desenhados dois iniciadores, HERBAS1 e HERBAS2, que foram testados quanto a sua especificidade contra 12 espécies diferentes de bactérias. Após, foram realizadas dez curvas padrões utilizando o iniciador HERBAS1 e diluições seriadas de DNA genômico de H. seropedicae SmR1. Foi obtida eficiência de 91% e coeficiente de correlação de 0,99. O limite de detecção observado foi de 101 cópias (correspondendo a 60,3 fg de DNA bacteriano) de H. seropedicae SmR1. O iniciador HERBAS1 foi utilizado para detecção e quantificação de H. seropedicae SmR1 em raízes de plântulas de milho inoculadas, as quais foram cultivadas in vitro e em potes, e coletadas 1, 4, 7 e 10 dias após a inoculação (DAI). Foi observado para as amostras in vitro um incremento no número de cópias nas amostras analisadas, variando de 107 cópias (um DAI) até 109 (dez DAI). Para o experimento em potes foi observado aproximadamente 106 cópias de H. seropedicae SmR1 nas amostras analisadas. Deste modo, o iniciador HERBAS1 mostrou-se específico para detectar e quantificar H. seropedicae SmR1, e este iniciador poderá ser utilizado para monitorar a interação entre planta-bactéria.<br>Abstract : The elevated use of fertilizers in agriculture is leading to several environmental problems, such as eutrophication of rivers and lakes, volatilization and run off. Aiming to reduce the amount of fertilizers used in agriculture, mainly the nitrogenous, the plant growth promoting bacteria (PGPB) has been employed, which when associated with crops, promote growth through the production and secretion of phytohormones, protect the host against phytopathogens and perform nitrogen biological fixation. Several PGPB species are found today, which are capable to establish an association with plants, however, Herbaspirillum seropedicae is the one that stands out as an important endophytic microorganism able to create an association with sereval economic importance crops, such as maize, rice, sorghum, wheat and sugar cane. The H. seropedicae bacteria strain SmR1 is a mutant spontaneously resistant to streptomycin antibiotic and had its genome sequenced and published in 2011. With the progress in the utilization of those bacteria as growth promoters, methods to detect and quantify the presence of these endophytic organisms are needed. In this sense, this study aimed the development of specific primers to identification and quantification of the PGPB H. seropedicae strain SmR1 in maize plants inoculated, through the Real Time PCR. Two primer pairs were designed, HERBAS1 and HERBAS2. They were tested regarding its specificity against 12 different species of bacteria. Afterwards, ten standard curves were performed using the HERBAS1 primer pair and serial dilutions of H. seropedicae SmR1 genomic DNA. Efficiency of 91% and correlation coefficient of 0.99 were obtained. The detection limit of 101 copies was observed (corresponding to 60.3 fg of bacterial DNA) of H. seropedicae SmR1. The HERBAS1 primer was used for detection and quantification of H. seropedicae SmR1 in inoculated maize roots, which were cultivated in vitro and in pots, and collected after 1, 4, 7 and 10 days after inoculation (DAI). Was observed for in vitro samples an increase in the copy number in the analyzed samples, ranging from 107 copies (one DAI) until 109 copies (ten DAI). In the pots experiment, was observed approximately 106 copies of H. seropedicae SmR1 in the analyzed samples. Therefore, the primer pair HERBAS1 proved to be sensitive enough to detect and quantify H. seropedicae SmR1, thus this primer pair could be used to monitor the plant-bacteria interaction