Expressão diferencial de genes de plântulas de milho inoculadas com Azospirillum brasilense FP2 e quantificação de DNA bacteriano por qPCR

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2013.Azospirillum spp. são bactérias Gram-negativas de vida livre que foram isoladas na rizosfera de gramíneas e cereais tanto de climas tropicais como de climas temperados. Possuem comocaracterísticas principais a capacidade de fixar o nitrogêniogasoso e produzir fitormônios. Acredita-se que ambos osprocessos são responsáveis por favorecer o crescimento das plantas. Assim, com o intuito de avaliar como esta bactéria promotora de crescimento vegetal influencia o desenvolvimentodo milho e como a planta reage à presença da mesma, foramcomparados o número de raízes laterais, o comprimento de parteaérea e raízes e a massa fresca destas, e a expressão dos genes dos receptores de etileno, dos transportadores efluxo e influxo de auxina, dos genes envolvidos no burst oxidativo, nasíntese de giberelinas e da via de sinalização MAPK emplântulas de milho (Zea mays) inoculadas e não inoculadas coma bactéria. Para isso, foram avaliadas duas variedades de milho(DKB240 e Pioneer 30F53) 1, 4, 7 e 10 dias após a inoculação(D.A.I.) com A. brasilense FP2. Além disso, o DNA bacteriano foiquantificado em plântulas inoculadas nestes tempos de coleta.Quanto às variáveis de crescimento, dentre as variedades demilho estudadas (DKB240 e Pioneer 30F53) somente foram detectadas diferenças estatísticas entre as plântulas inoculadas e não inoculadas quanto ao comprimento da parte aérea navariedade Pioneer 30F53 10 D.A.I. . Dessa forma, a partir dasamostras de milho Pioneer 30F53, foi realizada a identificação ea quantificação de DNA de Azospirillum brasilense FP2 nas amostras de milho inoculado em todos os tempos de coleta. Foi identificada a presença de DNA de A. brasilense FP2 nas amostras de milho inoculado por PCR convencional e posterior quantificação do DNA bacteriano nas amostras inoculadas foi realizada por meio de PCR em tempo real. Os dados de quantificação indicaram um aumento na quantidade de bactérias até 7 D.A.I. e uma diminuição destas na amostra 10 D.A.I..Também foram realizadas as análises de expressão gênica e foi possível detectar diferenças entre as amostras de plântulas inoculadas e não inoculadas para os transcritos avaliados(Zmaux1, Zmrboh, Zmmpk5, Zmga20ox4, Zmko1). A expressão observada para os genes envolvidos no burst oxidativo (ZmrbohAe ZmrbohB) e para o gene envolvido na cadeia transdutora de sinal (Zmmpk5) indica que existe resposta da planta à presença da bactéria, uma vez que houve aumento dos níveis de transcrito de Zmmpk5 assim como da quantidade de DNA bacteriano nas raízes das plântulas inoculadas até 7 D.A.I e ocorreu diminuição dos níveis deste transcrito e de DNA bacteriano aos 10 D.A.I. nas amostras de plântulas inoculadas, indicando que a planta responde à interação com a bactéria.<br>Abstract : Azospirillum spp. are Gram-negative bacteria of free-living that were isolated from the rhizosphere of grasses and cereals in both tropical and temperate climates. They have as main characteristic the ability to fix the nitrogen gas and produce phytohormones. It is believed that both processes are responsible for promoting plant growth. Thus, in order to evaluate how this plant growthpromoting bacterium influences the development of maize and how this plant reacts to the presence of the same, we compared the number of lateral roots, the length of roots and shoots and the fresh weight of them, and the expression of the ethylene gene receptor, of the genes of influx and efflux auxin transporters, of the genes involved in the oxidative burst, and in the synthesis of gibberellins, and in the MAPK signaling pathway in the maize plantlets (Zea mays) inoculated and non-inoculated with the bacteria. For this, were evaluated two maize varieties (Pioneer 30F53 and DKB240) with 1, 4, 7 and 10 days after inoculation (DAI) with A. brasilense FP2. In addition, bacterial DNA was quantified in inoculated plantlets at these times. As for the growth variables among the maize varieties studied (DKB240 and Pioneer 30F53), statistical differences were found between inoculated and non-inoculated plantlets on the shoot length for the variety Pioneer 30F53 10 DAI. From the samples of maize variety Pioneer 30F53, it was performed the identification and quantification of the DNA of Azospirillum brasilense FP2 from maize samples inoculated at all sampling times. We identified, by conventional PCR, the presence DNA of A. brasilense in corn samples inoculated with this bacterium and the quantification of DNA in the inoculated samples was performed by real time PCR. The data from the quantitation indicated an increase in amount of bacteria up to 7 DAI and a decrease at 10 DAI. Were also conducted analyzes of gene expression and it was possible to detect differences between the inoculated and non-inoculated plantlets for the transcripts analyzed (Zmaux1, Zmrboh, Zmmpk5, Zmga20ox4, Zmko1). The expression observed for the genes involved in the oxidative burst (ZmrbohA and ZmrbohB) and for the gene involved in the signal transduction chain (Zmmpk5) indicates that the plant responds to the presence of the bacterium, since there was a increasing both of the levels of transcripts of the gene Zmmpk5 as of the amount of bacterial DNA in the roots of the inoculated plantlets up to 7 DAI and, with 10 DAI, there was a decrease in the levels of this transcript and in the quantity of the bacterial DNA in the inoculated plantlets, indicating that the plant responds to the interaction with the bacterium