Variabilidade genética de Cryptococcus neoformans isolado de pacientes HIV positivos atendidos no Hospital Nereu Ramos de Florianópolis, Santa Catarina

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em BiotecnologiaA criptococose é uma infecção fúngica de distribuição mundial causada pela levedura encapsulada Cryptococcus neoformans. Esta doença é de grande importância em pacientes imunocomprometidos, podendo também acometer indivíduos imunocompetentes. A infecção pelo C. neoformans resulta da inalação basidiósporos, conídios ou blastoconídios pouco capsulados (4 a 5µm) presentes no ambiente, podendo inicialmente causar infecção sintomática ou assintomática na área subpleural dos pulmões, ser erradicada ou ainda permanecer dentro de um granuloma em estado latente. Este patógeno pode ser classificado em três variedades: C. neoformans var grubii (sorotipo A), com distribuição mundial, C. neoformans var neoformans (sorotipo D) freqüentemente encontrado na Europa e América do Sul e C. neoformans var gattii (sorotipos B e C) regiões tropicais e subtropicais e o híbrido sorotipo AD. No Brasil, as três variedades são os agentes etiológicos da criptococose em humanos. O objetivo deste estudo foi avaliar a variabilidade genética de amostras de C. neoformans isoladas de pacientes HIV positivos atendidos no Hospital Nereu Ramos de Florianópolis, Santa Catarina. Os 35 isolados clínicos analisados foram caracterizados como C. neoformans var grubii, sorotipo A, através da metodologia de PCR-RFLP do fragmento de 597 pb do gene CAP59. A PCR-fingerprinting com o iniciador M13 agrupou 34 isolados clínicos no padrão molecular VNI e uma amostra apresentou perfil distinto. A caracterização das 35 amostras através da técnica de RAPD utilizando 4 iniciadores aleatórios 3303, 3304, 3306 e 3307 mostrou baixa variabilidade genética das amostras. O sequenciamento do fragmento de 597 pb do gene CAP59 de duas amostras representativas juntamente com o padrão sorotipo A LMM794, mostrou uma homologia de 96% na seqüência nucleotídica e de aminoácidos predita com as seqüências de sorotipo A e AD depositadas no GenBank. Nossos resultados adicionam novas informações sobre a Biologia Molecular do C. neoformans no Estado de Santa Catarina. Cryptococcus neoformans is an encapsulated yeast-like fungus of worldwide distribution and the etiologic agent of cryptococcosis. This disease is a common opportunistic infection among patients with immunosupression and in apparently immunocompetent individuals. The infection is acquired by the inhalation of infectious propagules present in the environment. Therefore, the primary settlement of the pathogens is in the lungs, a site from which dissemination may occur. This fungus is classified in three varieties C. neoformans var. grubii (serotype A) of worldwide distribution, C. neoformans var. neoformans (serotype D) isolated rather frequently in Europe and South America, C. neoformans var. gattii (serotypes B and C) isolated in tropical and subtropical regions and a hybrid serotype AD. In Brazil, these three distinct neoformans varieties are the main casual agents of human cryptococcosis. The main goal of this dissertation is to study the genetic variability of C. neoformans samples isolated from patients attended at the Hospital Nereu Ramos Hospital, Florianópolis, Santa Catarina state, Brazil. Thirty-five clinical isolates were characterized, based on morphological and molecular data. All 35 clinical isolates were identified as C. neoformans var. grubii, representing serotype A, by PCR-RFLP analysis of CAP59 gene 597pb restriction fragment. A PCR-fingerprinting with the microsatellite-specific primer M13 grouped 34 isolates into the molecular type VNI and one showed distinct profile. The genetic variability among C. neoformans isolates were studied using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis. The four arbitrary polymerase chain reaction primers used in this study detected low genetic variability among the samples. The CAP59 nucleotide and predicted amino acid sequences analysis of two representative samples and serotype pattern A LMM794 of C. neoformans showed more than 96% similarity among serotype A and AD deposited in GenBank database. Our results add considerable new information to the available data on molecular biology of C. neoformans in the Santa Catarina State, Brazil