Produção de poli(3-hidroxibutirato) por linhagens de Escherichia coli DH5a e JM101 recombinantes

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia de AlimentosPoli-hidroxialcanoatos (PHAs) são uma família de polímeros biodegradáveis que muitos micro-organismos são capazes de sintetizar, sendo os mesmos considerados uma alternativa futura aos plásticos convencionais. O Poli(3-hidroxibutirato) (P(3HB)) é o PHA mais estudado. Técnicas de engenharia genética vem sendo desenvolvidas em Escherichia coli, um micro-organismo naturalmente não produtor de PHAs, para se estabelecerem processos de produção microbiana através das técnicas de DNA recombinante. Porém, antes de se submeterem determinadas linhagens a essas técnicas, é necessário que estas estejam bem caracterizadas. Desta forma, estudaram-se linhagens de E. coli, JM101 e DH5a, com os genes para a biossíntese de P(3HB) de C. necator, utilizando glicose como fonte de carbono. Para a linhagem DH5a as velocidades específicas máximas de crescimento foram de 0,79 h-1, para a cepa selvagem, e 0,21 h-1 para a recombinante. Os fatores de conversão de substrato em células foram de 0,32 e 0,20 (g.g-1), os fatores de conversão de oxigênio em células foram de 3,94 e 1,65 (g.g-1) e as velocidades específicas de consumo de oxigênio para manutenção celular foram 52,59 e 25,72 (g.g-1.h-1) para E.coli DH5a selvagem e recombinante, respectivamente. Os níveis de acúmulo de P(3HB) em E. coli DH5a alcançaram valores em torno de 56 %, com produtividade máxima de 0,23 g.L-1.h-1. Para a linhagem JM101 as velocidades específicas máximas de crescimento foram de 0,91 h-1 para a cepa selvagem e 0,72 h-1 para a recombinante. E. coli JM101 apresentou duas fases distintas de consumo de açúcares redutores. Assim, os fatores de conversão de substrato em células observados na primeira fase foram de 7,55 e 1,32 (g.g-1) e na segunda fase foram de 0,069 e 0,072 (g.g-1), os fatores de conversão de oxigênio em células foram de 2,95 e 2,85 (g.g-1) e as velocidades específicas de consumo de oxigênio para manutenção celular foram 55,23 e 58,89 (g.g-1.h-1) para E.coli JM101 selvagem e recombinante, respectivamente. Os níveis de acúmulo de P(3HB) em E. coli JM101 alcançaram valores em torno de 34 %, com produtividade máxima de 0,10 g.L-1.h-1. Com a análise conjunta dos dados experimentais é possível concluir que a inserção do plasmídeo pBHR68 em E. coli JM101 e DH5a afetou o desempenho celular, visto a diferença dos parâmetros cinéticos de crescimento e de respiração microbiana das cepas antes e depois da transformação. Os resultados observados sugerem que E. coli DH5a recombinante é mais adequado para produção de P(3HB), em meio LB adicionado de glicose, que E. coli JM101 recombinante, devido ao maior percentual de acúmulo (56 %) e maior produtividade de polímero (0,23 g.L-1.h-1).Polyhydroxyalcanoates (PHAs) are a family of biodegradable polymers synthesized for several bacteria. These polymers are considered a future alternative for conventional plastics. Poly(3-hydroxybutyrate) is the most widely studied PHA. Techniques of genetic engineering has been developed in Escherichia coli, a naturally non-producing PHAs microorganism, to establish processes of microbial production of P(3HB) through the techniques of recombinant RNA. However, before submitting E. coli strains to these techniques, it is necessary to investigate the strains and culture strategies. The present work examines two different strains of E. coli, JM101 and DH5a, a control strain and a P(3HB)-synthesizing strain, with the genes for biosynthesis of P(3HB) from C. necator, using glucose as a carbon source. The strain E. coli DH5a had a maximum specific growth rate of 0.79 h-1 for the control strain, and 0.21 h-1 for the recombinant strain, the carbon yield were 0.32 and 0.20 (g.g-1), the oxygen yield were 3.94 and 1.65 (g.g-1) and the oxygen consumption for maintenance were 52.59 e 25.72 (g.g-1.h-1), for the control strain and the recombinant strain, respectively. The P(3HB) accumulation in E. coli DH5a reached values around 56 %, with productivity of 0.23 g.L-1.h-1. For the strain E. coli JM101 the maximum speed of growth were 0.91 h-1 for the control strain and 0.72 h-1 for the recombinant. E. coli grows in two distinct phases, the carbon yield in the first phase were 7.55 and 1.32 (g.g-1) and in the second phase were 0.069 and 0.072 (g.g-1), the yield factors of oxygen in cells were 2.95 e 2.85 (g.g-1) and the oxygen consumption for maintenance were 55.23 and 58.89 (g.g-1.h-1) for the control strain and the P(3HB)-synthesizing strain, respectively. The P(3HB) accumulation in E. coli JM101 reached values around 34 %, with productivity of 0,10 g.L-1h-1.With this information it is possible to conclude that the insertion of the plasmid pBHR68 in E. coli JM101 and DH5á affected the metabolic. This fact was confirmed by the difference in growth parameters and microbial respiration of the strains before and after the transformation