Caracterização fenotípica e genotípica de cepas industriais geneticamente modificadas de Saccharomyces cerevisiae

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2011Leveduras Saccharomyces têm sido utilizadas em processos biotecnológicos para produção de etanol, graças à capacidade de adaptação ao ambiente industrial e à habilidade de fermentar açúcares. Com o intuito de otimizar o processo fermentativo de produção de álcool combustível, foi realizada a caracterização fenotípica e genotípica de linhagens industriais produtoras de etanol combustível no Brasil. Todas as cepas analisadas apresentaram capacidade de utilizar e fermentar maltose, indicando funcionalidade dos genes MAL. Em relação à utilização de maltotriose vários fenótipos foram observados. Algumas cepas apresentaram utilização lenta ou tardia deste açúcar, enquanto que outras foram incapazes de utilizar esta fonte de carbono. Todas a cepas apresentaram apenas o gene SUC2 no cromossoma IX, além de vários genes MALx1 no genoma. Enquanto que algumas linhagens não apresentaram o gene AGT1 no genoma, outras apresentaram pelo menos uma cópia no cromossomo VII, embora este gene, aparentemente, não seja funcional nestas linhagens industriais. Após substituição de uma cópia do gene SUC2 do genoma diplóide da levedura industrial CAT-1 com um módulo de transformação contendo um gene marcador (KanMX6), obtido do genoma de uma levedura de laboratório já modificada, verificou-se que a linhagem geneticamente modificada EDH-04 apresentava aproximadamente metade da atividade invertase, mas continuava consumindo e fermentando a sacarose do meio como sua parental, indicando que a atividade invertase não é o fator limitante na fermentação deste açúcar. A seguir, foi desenvolvido um novo módulo de transformação para substituir o gene SUC2 do genoma de leveduras utilizando o gene AGT1 (sob controle de um promotor constitutivo) como marcador. Espera-se que esta estratégia, incluindo o uso de regiões flanqueadoras longas, permita obter linhagens industriais brasileiras utilizadas na produção de álcool combustível sem atividade invertase, porém com transporte e hidrólise intracelular do açúcar pelas células, permitindo eficiente fermentação de sacarose por S. cerevisiae