Efeito do óxido nítrico nos mecanismos envolvidos na resistência a daunorrubicina em células de linhagem de leucemia mielóide aguda humana

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2010A Daunorrubicina (DNR) é amplamente utilizada na fase de indução do tratamento da Leucemia Mielóide Aguda (LMA). No entanto, o fenômeno de resistência a múltiplos fármacos (MDR), pode comprometer sua eficiência terapêutica como agente antineoplásico. Considerando que fármacos doadores de Óxido Nítrico (NO) têm sido investigados por terem um papel importante na sensibilização de células neoplásicas aos agentes quimioterápicos, o objetivo desse trabalho foi investigar o envolvimento do NO nos mecanismos moleculares de resistência à DNR em células de LMA de origem humana K562. Nossos resultados mostram que a incubação das células K562, com concentrações crescentes de DNR e de SNAP, um doador de NO, não causou morte celular significativa quando utilizados de forma individualizada. No entanto, a adição simultânea desses compostos, causou citotoxicidade de maneira concentração dependente. Para estudar os mecanismos pelos quais esses compostos provocaram morte celular, foi realizada a avaliação do ciclo celular, da expressão das proteínas antiapoptóticas Bcl-2 e survivina, proapotótica Bax e da caspase-3. A DNR (100 µM) e o SNAP (1mM) respectivamente causam bloqueio nas fases S e G0/G1 do ciclo celular na célula K562. Contudo, quando adicionados simultaneamente, o SNAP não altera o bloqueio causado pela DNR na fase S. Além disso, as células K562 apresentam de maneira constitutiva a expressão das proteínas antiapoptóticas Bcl-2 e survivina, e o tratamento com DNR e SNAP, isoladamente, não alteraram de forma significativa a expressão dessas proteínas. No entanto, a adição simultânea desses compostos causou redução de 40% e 70% na expressão de Bcl-2 e na survivina, respectivamente. A DNR e o SNAP também não alteram a expressão da proteína proapoptótica Bax, porém a associação desses compostos causou um aumento de 30% na expressão dessa proteína. A análise da distribuição intracelular de DNR nas células K562, por imunofluorescência mostra que a DNR acumula-se em regiões pontuais do citoplasma. Entretanto, quando as células K562 são tratadas com a associação de DNR e SNAP, há um acúmulo maior de DNR na célula e sua localização ocorre preferencialmente na região nuclear. Os resultados, obtidos na avaliação do acúmulo e retenção de DNR por citometria de fluxo, corroboram com esses resultados. Na análise da expressão dos genes abcc1 e lrp por RT-PCR, foi observado que as células K562 apresentam expressão constitutiva de ambos os genes. Em relação ao gene lrp, observamos que a DNR e o SNAP associados ou não causaram uma significativa diminuição na sua expressão. No entanto, a expressão do gene abcc1 não foi alterada na presença de SNAP e o tratamento com DNR causou uma pequena redução na sua expressão, a qual foi intensificada com a associação DNR e SNAP. A compilação das evidências obtidas nesse estudo nos permite sugerir que o NO inibe a atividade da abcc1, o que leva a um aumento intracelular de DNR, o qual permite que o fármaco atinja seu alvo de ação citotóxica no núcleo. Assim, o dano ao DNA causado pela DNR ativa a apoptose via mitocondrial pelo aumento da expressão da Bax e inibição das proteínas Bcl-2 e survivina, culminando na ativação da caspase 3 e indução da apoptose nas células de leucemia mielóide aguda K562.Daunorubicin (DNR) is widely used in the induction phase of the treatment for Acute Myeloid Leukemia (AML). However, multiple drug resistance (MDR) may compromise its therapeutic efficacy as an antineoplastic agent. Considering that Nitric Oxide (NO) donating drugs have been investigated for their important role in the sensitization of neoplastic cells to chemotherapy drugs, the goal of this work was to investigate the involvement of NO in the molecular mechanisms of resistance to DNR in human AML K562 cells. Our results have shown that the incubation of K562 cells, with increasing concentrations of DNR and SNAP (NO donors) did not cause significant cell death when used individually, but the simultaneous addition of these compounds produced cytotoxicity in a concentration-dependent manner. In order to study the mechanisms through which these compounds induce cell death, the cell cycle, the expression of anti-apoptotic proteins Bcl-2 and survivin, proapoptotic Bax, and caspase-3 were evaluated. DNR (100 ìM) and SNAP (1 mM) halt phases S and G0/G1 of the cell cycle in K562 cells, respectively. When added simultaneously, however, SNAP does not alter the block caused by DNR on phase S. Furthermore, K562 cells constitutively express anti-apoptotic proteins Bcl-2 and survivin, and treatment with DNR and SNAP separately does not significantly alter the expression of these proteins. Notwithstanding, the simultaneous addition of these compounds resulted in 40% and 70% reductions in the expression of Bcl-2 and survivin, respectively. DNR and SNAP also did not alter the expression of the proapoptotic protein Bax, but the association of both compounds resulted in a 30% increase in the expression of the same protein. The immunofluorescence analysis of the intracellular distribution of DNR in K562 cells shows that DNR accumulates in speckles in the cytoplasm. However, when K562 cells are treated with a mixture of DNR and SNAP, there is a greater accumulation of DNR in the cells, located primarily in the nuclear region. The results obtained in the evaluation of the accumulation and retention of DNR through flow cytometry support the previously mentioned findings. The RT-PCR analysis of the expression of abcc1and Irp genes showed that K562 cells constitutively express both genes. Regarding Irp, DNR and SNAP did not produce a significant decrease in its expression, either combined or separately. However, the expression of the abcc1 gene was not affected by the presence of SNAP but when treated with DNR its expression presented a small reduction, which was intensified by the association of DNR and SNAP. The compilation of evidence obtained in this study allows us to suggest that NO inhibits the activity of abcc1, leading to an intracellular increase in DNR, which allows this drug to reach its target of cytotoxic activity in the nucleus. Thus, the DNA damage caused by DNR triggers the mitochondrial apoptosis pathway with an increase in the expression of Bax and inhibition of Bcl-2 and survivin proteins, culminating in the activation of caspase-3 and the induction of apoptosis in acute myeloid leukemia K562 cells