Seleção de linhagens de Bacillus produtoras de polihidroxialcanoatos a partir de resíduo do processamento de mandioca

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos.Frente aos problemas ocasionados pelo uso dos plásticos de origem petroquímica, surgiu a necessidade de se buscarem alternativas para substituição deste material. Apresentam-se como solução os plásticos biodegradáveis, ou bioplásticos, que são polímeros com as propriedades desejáveis dos plásticos convencionais e rapidamente biodegradados quando descartados no ambiente. Dentre eles, estão os polihidroxialcanoatos (PHAs), poliésteres compostos por monômeros de ácidos 3-hidroxialcanóicos, os quais são acumulados intracelularmente por bactérias, como reserva de carbono e/ou energia, sob limitação de um nutriente essencial ao seu crescimento, e o polímero mais estudado atualmente é o P(3HB) - poli(3-hidroxibutirato). Entretanto, o custo de produção de PHAs é um dos responsáveis pela limitação de sua produção e comercialização. A utilização de substratos de baixo custo se torna um fator importante para a redução do custo de produção, além da busca e obtenção de linhagens eficientes na conversão do substrato em polímero. O objetivo deste trabalho foi selecionar, numa coleção de microrganismos do Laboratório de Microbiologia Aplicada - UNIVALI/SC, uma linhagem bacteriana capaz de produzir PHA a partir de resíduo do processamento de mandioca. Inicialmente, 72 isolados de Bacillus, Paenibacillus e Geobacillus de 21 espécies diferentes foram cultivados em meio com limitação de fósforo e 20g/L de resíduo industrial oriundo do processamento de mandioca, rico em amido e açúcares redutores. Foram avaliados o crescimento dos microrganismos em meio com substrato amiláceo (técnica de MTT), sua capacidade de secretar enzimas no meio (avaliação de degradação de amido) e a produção de PHA (cultivo com corante vermelho do Nilo e observação em microscópio de epifluorescência). Finalmente foram selecionados 4 isolados: LAMA073, LAMA095, LAMA262 e LAMA265, classificados por métodos moleculares como Bacillus megaterium, os quais foram capazes de produzir P(3HB) a partir do resíduo amiláceo. O resíduo industrial utilizado mostrou-se, portanto, um substrato carbônico aplicável à produção de compostos de maior valor agregado, como P(3HB). Os isolados LAMA073, LAMA095, LAMA262 e LAMA265 acumularam 13,04% (p/p), 23,88% (p/p), 5,92% (p/p), e 25,00% (p/p) de P(3HB), respectivamente, a partir de 20% de resíduo hidrolisado adicionado ao meio. Quando adicionado resíduo hidrolisado na concentração de 40%, os isolados LAMA073 e LAMA095 apresentaram aumento na produção de P(3HB), para 30,45% (p/p) e 29,78% (p/p), respectivamente. A espectroscopia na região do infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), das amostras de PHAs produzidos, mostraram bandas características da presença de P(3HB), confirmando a produção deste polímero pelos microrganismos. Portanto, os isolados identificados e caracterizados apresentam potencial para a produção de P(3HB) em substrato de baixo custo, sendo um próximo passo avaliá-los em uma escala superior de produção, bem como em outros resíduos amiláceos. There are many problems caused by use of petrochemical plastics, then it is necessary to find alternatives to replace this material. A solution for this problem is the use of biodegradable plastic, or bioplastics, which are polymers with desirable properties of conventional plastics, and they are rapidly biodegraded in the environment when they are discarded. Among the biodegradable plastics, there are the polyhydroxyalkanoates (PHAs), polyester containing hydroxyalkanoic acid monomers. They are accumulated intracellularly by bacteria as carbon or energy reserves, when there is a limitation of an essencial nutrient, and P(3HB) - poly(3-hydroxybutyrate) is the most studied polymer nowadays. However, the use of PHA is limited due to its high cost production. The use of low cost by-products becomes the main factor for the reduction of production cost, besides that it is also necessary to obtain strains for efficient substrate conversion into polymer. The objective of this work was to select a bacterial strain capable of producing PHA from cassava by-products as carbon source. First screening was conduced with 72 strains from culture collection of the Applied Microbiology Laboratory (UNIVALI/SC/Brazil), covering three generas (Bacillus, Geobacillus and Paenibacillus) and 21 different species, which were cultivated in Minimal Medium (MM) with limited phosphate and 20g/L of cassava by-product. It was evaluated microorganisms growth (measuring respiration by MTT assay) in medium with starchy substrate, their ability to secrete enzymes (starch degradation) and PHA production (Nile red dying assay and observation in epifluorescence microscope). Finally 4 isolates were selected: LAMA073, LAMA095, LAMA262 and LAMA265, classified by molecular methods (16S rRNA sequencing) as Bacillus megaterium, which were capable of producing P(3HB) from cassava processing by-products as a sole carbon source. Strains LAMA073, LAMA095, LAMA262 and LAMA265 were able to produce 13,04% of P(3HB) (w/w), 23,88% (w/w), 5,92% (w/w) and 25,00% (w/w) respectively, when cultivated in MM supplemented with 20% of hydrolized cassava by-product. However, when 40% of hydrolized cassava by-product was used, higher P(3HB) percentage, 30,45% and 29,78% (w/w), was observed for LAMA073 and LAMA095, respectively. Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) showed characteristic bands of P(3HB) presence, confirming polymer production by microorganisms. Therefore, the identified and characterized strains have potential to produce P(3HB) in low-cost substrate, and a next study would be evaluate them on a higher scale of production, as well as production in others starchy waste