Estratégias de cultivo e recuperação e caracterização de poli (3-hidroxibutirato) produzido por Ralstonia eutropha

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia QuímicaPolihidroxialcanoatos (PHAs) são polímeros sintetizados por vários microrganismos e armazenados na forma de reserva de energia e carbono. Sua produção se dá sob condições desfavoráveis de crescimento, como limitação de nitrogênio ou fósforo, e na presença de excesso de fonte de carbono. Poli(3-hidroxibutirato) (P(3HB)) é o polímero mais estudado dentre os PHAs, possuindo características próximas às encontradas no polipropileno. Os PHAs chamam atenção devido à sua biodegradabilidade e possibilidade de substituição dos plásticos petroquímicos. Embora os PHAs apresentem vantagens ambientais sobre os plásticos de origem petroquímica, a sua principal desvantagem é o alto custo de produção, principalmente relativo ao substrato, recuperação e extração do polímero. Neste trabalhou teve-se por objetivo a melhoria das condições de cultivo para o crescimento e produção de P(3HB) por R. eutropha em diferentes temperaturas, seguido de um estudo de extração, caracterização e recuperação do polimero obtido. Os experimentos foram conduzidos em culturas em biorreator utilizando como microrganismo produtor a bactéria Ralstonia eutropha DSM 545. O processo foi dividido em duas fases sendo a primeira um crescimento balanceado e a segunda um crescimento desbalanceado com carência de nitrogênio para acúmulo intracelular do polímero. Primeiramente, a modelagem matemática do crescimento da bactéria foi utilizada para estimar os parâmetros: velocidade específica de crescimento ( max), tempo da fase lag ( ) e aumento logarítmico da população (A), posteriormente definiu-se a melhor temperatura de cultivo para o crescimento e produção de P(3HB) por Ralstonia eutropha. Os modelos de Gompertz Modificado e o Logístico foram ajustados às curvas de crescimento. O modelo que melhor se ajustou aos dados experimentais foi o Modelo de Gompertz Modificado. Não foi possível a obtenção de um modelo secundário que descrevesse a influência da temperatura sobre os parâmetros de crescimento µ, e A, nas diferentes temperaturas de cultivo testadas. A temperatura que proporcionou as melhores condições de cultivo tanto para o crescimento quanto para a produção de P(3HB) foi a temperatura de 32,5ºC, onde nesta condição obteve-se uma produção de P(3HB) de 70,3% em 26,5 horas de cultivo, com uma produtividade de 0,47 g.L-1h-1. O estudo da respirometria como alternativa para definição do estado fisiológico da célula e como ferramenta indicativa de limitações de nutrientes durante a produção de P(3HB) também foi realizado deste trabalho. Foi observado que, para concentrações de substrato inferiores a 12g/L, a cultura começa a sofrer uma desaceleração na sua velocidade específica de respiração (QO2), tornamdo-se um fator limitante na produção de P(3HB). Foi possível visualizar também, através do acompamamento da velocidade específica de respiração, o momento em que começa a ocorrer a limitação de nitrogênio e, consequentemente, o início da produção de P(3HB), isto é indicado através do início da sua desaceleração, o que passa a ser mais acentuado a partir do momento em que ocorre a exaustão do nitrogênio no meio. Como última parte deste estudo, foram realizados testes em diferentes condições de pré-tratamentos celular antes da extração, e testes durante a extração variando-se o tempo e a temperatura, utilizando como solvente o carbonato de propileno. Nesta etapa, observou-se que o melhor resultado foi obtido nas extrações realizadas com pré-tratamento de pH e temperatura de extração a 130ºC/30 min onde obte-se um peso molecular de 1,3.106g/mol, com uma recuperação e pureza de 96,3% e 94,6%. O conjunto de dados obtidos neste trabalho é bastante relevante para a melhoria do processo de produção de P(3HB) Polyhydroxyalkanoates (PHAs) are polymers synthesized by various microorganisms and stored as reserve of energy and carbon. Their production occurs under unbalanced growth conditions, such as limitation of nitrogen or phosphorus and excess of carbon source. Polyhydroxybutyrate (P(3HB)) is the most studied polymer among the PHAs since its physical properties are remarkably similar to those of polypropylene. The PHAs are important due to their biodegradability and also because the possibility to use them rather than petrochemical plastics. Although PHAs show ecological advantages over petrochemical plastics, their main disadvantage is the high cost of production, mainly due to the polymer substrate, recovery and extraction. In this work, the target was to improve the culture conditions for growth and production of P(3HB) by Ralstonia eutropha in different temperatures, following by the study of extraction, characterization and recovery of the polymeric obtained. The experiments were carried out in a bioreactor using Ralstonia eutropha DSM 545. The process was divided in two phases. The first phase was characterized by balanced growth conditions and the second one occurred under unbalanced growth conditions such as limitation of nitrogen in order to produce intracellular polymer accumulation. Firstly, the mathematical modeling of bacteria growth was used to estimate the following parameters: maximum specific growth rate ( max), time of lag phase ( ) and logarithmic increase of population (A). After, the best cultivation temperature was defined in order to produce P(3HB) by Ralstonia eutropha. The growth models "Modified Gompertz" and "Logistic" was fit to the growth curves. The best model fitted to the experimental data was Modified Gompertz. It was not possible to find a secondary model able to describe the influence of temperature over growth parameters µmax, and A in the different cultivation temperatures tested. The best cultivation temperature for growth and for P(3HB) production was 32.5°C, in which 70.3% of P(3HB) was produced in 26.5 hours of cultivation, with productivity of 0.47 g.L-1h-1. The respirometry study, as a alternative for definition of the physiologic state of the cell and also as a toll which give indication of nutrients limitation during the P(3HB) production, was done in this work too. It was observed that when the concentration of substrate was under 12g/L, the culture start to suffer a slowdown of its specific respiration rate (QO2), becoming itself a limiting factor of P(3HB) production. It was also possible to see, following the specific respiration rate, the exactly moment when begins the nitrogen limitation and, consequently, the P(3HB) production phase. This phase is indicated by the decrease of QO2 value, followed by the acceleration of this diminution when the exhaustion of nitrogen occurs in the media. In the last step of this study, tests were made in different conditions of cellular pre-treatment before extraction and tests were made during the extraction under different time and temperature conditions, using propylene carbonate as a solvent. In this step, it was observed that the best results was found when the extractions were made with pre-treatment of pH and temperature of extraction at 130°C/30 min which was obtained molecular weight of 1.3 x 106g/mol and recuperation and purity of the 96.3% and 94.6%, respectively. The set of the data obtained in this work is enough relevant to the improvement of the P (3HB) production process.