Identificação e caracterização de sequências codificadoras de peptídeos antimicrobianos (PAM) nas células da hemolinfa de espécies nativas de peneídeos marinhos

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em BiotecnologiaProteínas ou peptídeos antimicrobianos (PAM) são componentes essenciais do sistema imune inato e encontram-se amplamente distribuídos entre vertebrados, invertebrados e plantas. São moléculas relativamente pequenas, de caráter anfipático e catiônico, podendo apresentar uma atividade microbicida rápida e potente contra um amplo espectro de microrganismos. Em camarões peneídeos, três classes de PAM foram isoladas e caracterizadas molecular e funcionalmente, a partir de suas células sangüíneas ou hemócitos: peneidinas (PEN), crustinas (CRUS) e os fatores anti-lipopolissacarídeos (ALF). O objetivo desse estudo foi o de detectar, clonar e caracterizar molecularmente seqüências semelhantes a PEN, CRUS e ALF nos hemócitos de três espécies nativas de camarões peneídeos Farfantepenaeus paulensis, F. subtilis e Litopenaeus schmitti, além de elaborar filogramas a partir das seqüências obtidas. Através da utilização de iniciadores desenhados a partir de regiões de consenso de seqüências disponíveis em bancos gênicos públicos, foi possível amplificar fragmentos de cDNA correspondentes às três classes de PAM acima mencionadas nos diferentes peneídeos. Em F. subtilis foi clonada uma seqüência semelhante à PEN do subgrupo 2 denominada de Farsub PEN2-1 (GenBank: EF450742), codificando para um peptídeo maduro de 54 aminoácidos, altamente catiônico e com alta identidade aminoacídica com as PEN2 de F. paulensis (91-93%). Em L. schmitti, mas não nos outros peneídeos, foi possível obter um produto de amplificação correspondendo a uma seqüência de ALF, cujo peptídeo maduro consiste de 98 aminoácidos, com similaridades aminoacídicas de 93 e 95% com F. chinensis e L. vannamei, respectivamente. Esta seqüência, denominada Litsch ALF (GenBank: DQ991357) codifica para uma molécula altamente catiônica e contém, assim como outras seqüências de ALF, uma região anfipática entre dois resíduos conservados de cisteína. Já, seqüências similares a CRUS foram obtidas nas três espécies de peneídeos analisados, sendo denominadas de Farsub CRUS (127 aminoácidos, GenBank: EF450744), Farpau CRUS (150 aminoácidos, GenBank: EF182747) e Litsch CRUS (148 aminoácidos, GenBank: EF182748). As três seqüências codificam para peptídeos contendo uma região N-terminal hidrofóbica rica em resíduos de glicina e uma região C-terminal com doze resíduos conservados de cisteína, onde se encontra um domínio WAP. Todas as seqüências de CRUS obtidas apresentaram alta similaridade aminoacídica com as diferentes isoformas de CRUS do camarão L. vannamei (em torno de 85%). Este foi o primeiro relato da presença de ALF e CRUS em camarões peneídeos nativos brasileiros. A PEN já havia sido detectada em F. paulensis e L. schmitti. Atualmente, alguns dos PAM identificados estão em fase de expressão em sistema recombinante, para posteriormente determinar seu espectro de ação frente a diferentes grupos de microrganismos e verificar seu potencial como agente terapêutico em saúde humana, veterinária e aqüicultura. Antimicrobial proteins or peptides (AMP) are major components of the immune system, which are widely distributed among vertebrates, invertebrates and plants. They are small cationic and amphipatic molecules that exhibit a rapid and potent activity against a broad range of microorganisms. In penaeid shrimp, three different classes of AMP have been isolated and molecular and functionally characterized from the blood cells or hemocytes: penaeidins (PEN), crustins (CRUS) and anti-lipopolysaccharide factors (ALF). The main purpose of this study was to detect, clone and molecularly characterize, gene sequences similar to PEN, CRUS and ALF from the hemocytes of the indigenous penaeid shrimp Farfantepenaeus paulensis, F. subtilis and Litopenaeus schmitti and also construct philograms from the obtained sequences It was possible to amplify cDNA sequences of the three AMP classes mentioned above, using primers based on consensus regions of corresponding sequences available at the GenBank. In F. subtilis, a PEN-like sequence, belonging to the subgroup 2, was cloned and named Farsub PEN2-1 (GenBank: EF450742). It coded for a mature peptide composed of 54 amino acids, highly cationic, and exhibited a high amino acidic identity with PEN2 isoforms of F. paulensis (91-93%). In L. schmitti, but not in other penaeids, one amplification product corresponding to an ALF-like sequence was obtained and called Litsch ALF (GenBank: DQ991357). It coded for a mature peptide of 98 amino acids exhibiting 93 and 95% of amino acid similarity with the ALF of F. chinensis and L. vannamei respectively. On the other hand, CRUS-like sequences were obtained in all three penaeid species, and were named Farsub CRUS (127 amino acids, GenBank: EF450744), Farpau CRUS (150 amino acids, GenBank: EF182747) and Litsch CRUS (148 amino acids, GenBank: EF182748). The three CRUS sequences coded for peptides containing a hydrophobic N-terminal sequence rich in glycine residues and a C-terminal sequence with twelve conserved cysteine residues and a WAP domain. All obtained CRUS sequences had amino acid similarity with different isoforms of L. vannamei CRUS (about 85%). This is the first report of ALF and CRUS sequences in indigenous Brazilian penaeid shrimp. PEN sequences were already described in F. paulensis e L. schmitti. Some of the cloned AMP are presently under expression through recombinant system, for further evaluate their antimicrobial activity spectra and their potential use as therapeutic agents for human and veterinary health and also aquaculture