Análise da fermentação de maltose e maltotriose por saccharomyces cerevisiae

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia.A fermentação da maltose e maltotriose por Saccharomyces cerevisiae é de fundamental importância para diversas aplicações industriais desta levedura. No presente trabalho foi analisado aspectos do metabolismo destes açúcares relevantes para os processos de panificação e cervejaria. Por exemplo, células de leveduras continuam fermentando a massa do pão mesmo quando submetidas a refrigeração, sendo esta uma característica indesejável nas cepas de panificação. Uma vez que a maltose é o principal açúcar encontrado na massa do pão, a influência do frio (10ºC) na fermentação deste açúcar foi analisada em uma cepa selvagem de S. cerevisiae, e numa cepa csf1. mutante incapaz de transportar glicose e leucina a baixas temperaturas. A baixa temperatura afeta a cinética da fermentação por diminuir a velocidade de crescimento e rendimento celular final, com quase nenhum etanol produzido a partir de maltose pelas células selvagens a 10oC. A cepa csf1. foi incapaz de crescer em maltose a 10oC, indicando que o gene CSF1 é também necessário para a utilização de maltose a baixas temperaturas. Entretanto, o mutante csf1. também mostrou inibição acentuada da fermentação de glicose e maltose por estresse salino, além de uma significativa sensibilidade a uma série de compostos tóxicos, incluindo higromicina B, Ca2+, tetrametilamônio e pH ácido, mas não a altas concentrações de K+. Estes resultados indicam que o gene CSF1 estaria também envolvido na regulação de outros processos fisiológicos, incluindo a homeostase iônica. Em cervejaria a otimização do processo fermentativo depende da eficiente utilização de maltose e maltotriose pelas células de S. cerevisiae. Entretanto, as leveduras têm dificuldade de fermentar a maltotriose, e a incompleta utilização deste açúcar resulta, por exemplo, em uma cerveja de baixa qualidade, com um elevado extrato filtrável e sabor atípico. Para tentar compreender melhor a metabolização da maltotriose, a utilização deste açúcar foi analisada em cepas de S. cerevisiae com genótipos definidos e deletadas, ou não, em permeases específicas. A cepa selvagem analisada cresce lentamente em maltotriose, somente após uma extensa fase lag, sem produzir etanol durante o crescimento. Este fenótipo (crescimento lento e não fermentativo) não foi alterado pela deleção do gene AGT1, indicando que outro(s) transportador(es) estaria(m) provavelmente envolvido(s) na lenta utilização da maltotriose. Por outro lado uma cepa deletada nos transportadores de hexoses (hxt1-7. gal2.) fermentou eficientemente a maltotriose, mas quando o gene AGT1 foi deletado do genoma a cepa voltou a respirar este açúcar, indicando que a permease codificada pelo AGT1 é fundamental para a fermentação da maltotriose. Uma vez que a expressão constitutiva dos genes MAL é uma característica altamente desejável em cepas de panificação e cervejaria, decidiu-se analisar a contribuição que um gene regulador constitutivo teria na fermentação da maltotriose. Enquanto que algumas cepas MAL constitutivas foram capazes de fermentar eficientemente a maltotriose, a transformação de uma cepa selvagem incapaz de fermentar este açúcar com um plasmídeo contendo o gene MAL63c não melhorou a produção de etanol a partir de maltotriose. Estes resultados indicam a existência de outros fatores necessários para a eficiente fermentação de maltotriose por Saccharomyces cerevisiae. and maltotriose fermentation by Saccharomyces cerevisiae is of prime importance for several industrial applications of this yeast. In this work we have analyzed several aspects of the metabolism of these sugars relevant to the brewing and baking processes. For example, yeast cells still ferment the dough under refrigerated conditions, a characteristic highly undesirable for backing strains. Since maltose is the most abundant sugar in backing dough, we have studied the influence of cold temperature (10oC) on the fermentation of maltose by a S. cerevisiae wild-type strain, and a csf1. mutant impaired in glucose and leucine uptake at low temperatures. Cold temperature affected the fermentation kinetics by decreasing the growth rate and the final cell yield, with almost no ethanol been produced from maltose by the wild-type cells at 10oC. The csf1. strain did not grew on maltose when cultured at 10oC, indicating that the CSF1 gene is also required for maltose consumption at low temperatures. However, this mutant also showed increased inhibition of glucose and maltose fermentation under salt stress, and an increased sensitivity to several toxic compounds, including hygromycin B, Ca2+, tetramethylammonium and acidic pH, but not to high K+ concentrations. These results indicate that the CSF1 gene is probably involved in the regulation of other physiological processes, including ion homeostasis. Fermentation process optimization in the brewing industry depends on the efficient utilization of maltose and maltotriose by S. cerevisiae. However, yeasts have a difficulty to ferment maltotriose, and the incomplete utilization of this sugar results, for example, in a low quality beer with high content of fermentable sugars and atypical flavor profiles. To further understand the utilization of maltotriose, we analyzed the uptake of this sugar in yeasts strains with defined genotypes, deleted or not in specific transporters. The wild-type strain analyzed grows slowly in maltotriose, only after an extensive lag phase, and no ethanol was produce during growth. This phenotype (slow growth with no fermentation) was not affected by deletion of the AGT1 gene, indicating that probably other transporters may be involved in the slow utilization of maltotriose. On the other hand, a strain that was deleted in the hexose transporters (hxt1-7. gal2.) fermented maltotriose efficiently, but when the AGT1 gene was disrupted from the genome the strain started to respired the sugar, indicating that the AGT1 permease is required for maltotriose fermentation. Since the constitutive expression of MAL genes is a desired property of baker#s and brewery#s strains, we analyzed the contribution that a constitutive regulatory gene would have in maltotriose fermentation. While some MAL constitutive strains were capable to efficiently ferment maltotriose , the transformation of a wild-type strain incapable to ferment this sugar with a plasmid harboring the MAL63c gene did not improve ethanol production from maltotriose. These results indicate the existence of other factors required for the efficient fermentation of maltotriose by Saccharomyces